QPCR ପରୀକ୍ଷଣରେ, ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ମଧ୍ୟ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଲିଙ୍କ୍ |ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକ ଉପଯୁକ୍ତ କି ନୁହେଁ, ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ମାନକକୁ ପହଞ୍ଚେ କି ନାହିଁ, ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କି ନୁହେଁ ଏବଂ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ ଉପଲବ୍ଧ କି ନାହିଁ ତାହା ସହିତ ଜଡିତ |
ତେବେ qPCR ପ୍ରାଥମିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ କିପରି ଉନ୍ନତ କରାଯିବ?ଉଚ୍ଚ ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା?
ଆଜି, ଆମେ ଆପଣଙ୍କୁ qPCR ପ୍ରାଇମର୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଏକତ୍ର ଡିଜାଇନ୍ କରିବାକୁ ନେଇଯିବା, ଏବଂ qPCR ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍କୁ ପରୀକ୍ଷଣରେ ଏକ ଦକ୍ଷ ଦକ୍ଷ କ ill ଶଳ ହେବାକୁ ଦିଅନ୍ତୁ |
QPCR ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବାବେଳେ, ସାଧାରଣତ the ନିମ୍ନଲିଖିତ ବିନ୍ଦୁଗୁଡିକ ପ୍ରତି ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ: ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଯଥାସମ୍ଭବ ଇଣ୍ଟ୍ରନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଡିଜାଇନ୍ ହେବା ଉଚିତ୍, ଉତ୍ପାଦର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ 100-300 ବିପି ହେବା ଉଚିତ, Tm ମୂଲ୍ୟ ଯଥା ସମ୍ଭବ 60 ° C ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଯଥାସମ୍ଭବ ନିକଟତର ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ ପ୍ରାଇମରର ଶେଷ G କିମ୍ବା C ଇତ୍ୟାଦି ଅପେକ୍ଷା କରନ୍ତୁ |
1. ଇଣ୍ଟ୍ରନ୍ ବିସ୍ତାର କରୁଥିବା ପ୍ରାଇମରଗୁଡିକର ଡିଜାଇନ୍ |
QPCR ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବାବେଳେ, ଇଣ୍ଟ୍ରନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନ କରିବା ଦ୍ୱାରା gDNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ pl ଼ିବାରେ ରୋକିପାରେ, ଏବଂ ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକ cDNA ର ବିସ୍ତାରରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଥାଏ, ଏହିପରି gDNA ପ୍ରଦୂଷଣର ପ୍ରଭାବକୁ ଦୂର କରିଥାଏ |
2. ପ୍ରାଥମିକ ଲମ୍ବ |
ପ୍ରାଥମିକ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ସାଧାରଣତ 18 18-30 nt ମଧ୍ୟରେ ଥାଏ, ଏବଂ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦ୍ରବ୍ୟର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ଯଥାସମ୍ଭବ 100-300 ବିପି ମଧ୍ୟରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହେବା ଉଚିତ |
ଯଦି ପ୍ରାଇମର୍ ବହୁତ ଛୋଟ, ଏହା ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାରକୁ ନେଇଥାଏ, ଏବଂ ଯଦି ଏହା ବହୁତ ଲମ୍ବା ହୁଏ, ତେବେ ଏହା ସହଜରେ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ (ଯେପରିକି ହେୟାରପିନ ଗଠନ) ସୃଷ୍ଟି କରିବ |ଯଦି ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପ୍ରଡକ୍ଟ ବହୁତ ଲମ୍ବା, ତେବେ ଏହା ପଲିମେରିସର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ନୁହେଁ, ଯାହା PCR ଏମ୍ପ୍ଲାଇସିସ୍ ର ଦକ୍ଷତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ |
3. GC ବିଷୟବସ୍ତୁ ଏବଂ Tm ମୂଲ୍ୟ |
ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକର GC ବିଷୟବସ୍ତୁ 40% ରୁ 60% ମଧ୍ୟରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହେବା ଉଚିତ୍ |ଯଦି ଏହା ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ କିମ୍ବା ଅତ୍ୟଧିକ କମ୍, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଆରମ୍ଭ କରିବା ପାଇଁ ଏହା ଅନୁକୂଳ ନୁହେଁ |ସମାନ Tm ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ପାଇବା ପାଇଁ ଫରୱାର୍ଡ ଏବଂ ରିଭର୍ସ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକର GC ବିଷୟବସ୍ତୁ ସମାନ ହେବା ଉଚିତ |
Tm ମୂଲ୍ୟ ଯଥା ସମ୍ଭବ 55-65 ° C ମଧ୍ୟରେ ରହିବା ଉଚିତ୍, ସାଧାରଣତ around ପ୍ରାୟ 60 ° C, ଏବଂ ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମର Tm ମୂଲ୍ୟ ଯଥାସମ୍ଭବ ନିକଟତର ହେବା ଉଚିତ୍, ବିଶେଷତ 4 4 ° C ରୁ ଅଧିକ ନୁହେଁ |
4. ପ୍ରାଇମରର 3 ′ ଶେଷରେ A ଚୟନ କରିବା ଠାରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |
ଯେତେବେଳେ ପ୍ରାଇମରର 3 ′ ଶେଷ ମେଳ ଖାଉ ନାହିଁ, ବିଭିନ୍ନ ଆଧାରର ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଦକ୍ଷତାରେ ବହୁତ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଅଛି |ଯେତେବେଳେ ଶେଷ ବେସ୍ A ଅଟେ, ଏହା ଅସନ୍ତୁଷ୍ଟ କ୍ଷେତ୍ରରେ ମଧ୍ୟ ଶୃଙ୍ଖଳା ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭ କରିପାରିବ, ଏବଂ ଯେତେବେଳେ ଶେଷ ବେସ୍ ଟି ଯେତେବେଳେ, ମେଳ ଖାଇବାର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ବହୁ ମାତ୍ରାରେ କମିଯାଏ |ତେଣୁ, ପ୍ରାଇମରର 3 ′ ଶେଷରେ A ଚୟନ ନକରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ଟି ବାଛିବା ଭଲ |
ଯଦି ଏହା ଏକ ପ୍ରୋବ ପ୍ରାଇମର୍ ଅଟେ, ତେବେ ଅନୁସନ୍ଧାନର 5 ′ ଶେଷ G ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ, କାରଣ ଯେତେବେଳେ ଗୋଟିଏ G ବେସ୍ FAM ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରିପୋର୍ଟର ଗୋଷ୍ଠୀ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ, G ମଧ୍ୟ FAM ଗୋଷ୍ଠୀ ଦ୍ itted ାରା ନିର୍ଗତ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗନାଲ୍କୁ ଲିଭାଇ ଦେଇପାରେ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ମିଥ୍ୟା ନକାରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳ |ଦୃଶ୍ୟମାନ ହୁଅ |
5. ଆଧାର ବଣ୍ଟନ |
ପ୍ରାଇମେରରେ ଚାରୋଟି ଆଧାରର ବଣ୍ଟନ ବିଶେଷତ r ଅନିୟମିତ, 3 ′ ଶେଷରେ କ୍ରମାଗତ 3 ରୁ ଅଧିକ G କିମ୍ବା C ଏବଂ କ୍ରମାଗତ 3 ରୁ ଅଧିକରୁ ଦୂରେଇ ରହିବ |ଜି କିମ୍ବା ସି ଜିସି ସମୃଦ୍ଧ କ୍ରମ ଅଞ୍ଚଳରେ ଯୋଡି ସୃଷ୍ଟି କରିବା ସହଜ |
6. ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ଅଞ୍ଚଳ ଜଟିଳ ଦଳୀୟ ଗଠନରୁ ଦୂରେଇ ରହିବା ଉଚିତ୍ |
ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦର ଏକକ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ ଦ୍ୱାରା ଗଠିତ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ PCR ର ସୁଗମ ପ୍ରଗତି ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ |ଆଗୁଆ ଲକ୍ଷ୍ୟ କ୍ରମରେ ଦ୍ secondary ିତୀୟ structure ାଞ୍ଚା ଅଛି କି ନାହିଁ ପୂର୍ବାନୁମାନ କରି, ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ରେ ଏହି ଅଞ୍ଚଳକୁ ଏଡାଇବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ |
7. ପ୍ରାଥମିକମାନେ ନିଜେ ଏବଂ ପ୍ରାଥମିକମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଲଗାତାର ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଆଧାରକୁ ଏଡ଼ାଇବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରିବା ଉଚିତ୍ |
ପ୍ରାଇମର୍ ନିଜେ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ କ୍ରମାଗତ 4 ଆଧାର ସଂପନ୍ନତା ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |ପ୍ରାଇମର୍ ନିଜେ ଏକ ସଂପୃକ୍ତ କ୍ରମ ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ, ନଚେତ୍ ଏହା ଏକ ହେୟାରପିନ ଗଠନ ପାଇଁ ନିଜକୁ ଫୋଲ୍ଡ୍ କରିବ, ଯାହା ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ମିଶ୍ରଣକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିବ |
ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ କ୍ରମ ବିଦ୍ୟମାନ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ସଂପନ୍ନତା ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଉତ୍ପାଦନ କରିବ, ଯାହା PCR ଦକ୍ଷତା ହ୍ରାସ କରିବ ଏବଂ ପରିମାଣିକ ସଠିକତା ଉପରେ ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ |ଯଦି ପ୍ରାଇମର୍-ଡାଇମର୍ ଏବଂ ହେୟାରପିନ ଗଠନଗୁଡିକ ଏଡିବାଯୋଗ୍ୟ, △ G ମୂଲ୍ୟ ଅଧିକ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ (4.5 kcal / mol ରୁ କମ୍ ହେବା ଉଚିତ) |
8. ପ୍ରାଥମିକମାନେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉତ୍ପାଦକୁ ବୃଦ୍ଧି କରିଥାଏ |
QPCR ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ମୂଳ ଲକ୍ଷ୍ୟ ହେଉଛି ଲକ୍ଷ୍ୟ ଜିନ୍ ର ପ୍ରଚୁରତା ବୁ to ିବା |ଯଦି ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାର ହୁଏ, ପରିମାଣ ଭୁଲ ହେବ |ତେଣୁ, ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକ ଡିଜାଇନ୍ ହେବା ପରେ, ସେମାନଙ୍କୁ ବ୍ଲାଷ୍ଟ ଦ୍ୱାରା ପରୀକ୍ଷା କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା କ୍ରମ ଡାଟାବେସରେ ତୁଳନା କରାଯାଏ |
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ମାନବ GAS6 (ଅଭିବୃଦ୍ଧି ଗିରଫ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ 6) ଜିନ୍ କୁ qPCR ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ ଗ୍ରହଣ କରୁ |
01 ଜିଜ୍ଞାସା ଜିନ୍ |
ହୋମୋ GAS6 |NCBI ମାଧ୍ୟମରେ |ଏଠାରେ, ଜିନ୍ ନାମ ଏବଂ ପ୍ରଜାତିଗୁଡିକ ତୁଳନା କରିବାକୁ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଉଚିତ୍ ଯେ ସେମାନେ ସ୍ଥିର ଅଟନ୍ତି |
02 ଜିନ୍ କ୍ରମ ଖୋଜ |
(1) ଯଦି ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମ ଜେନୋମିକ୍ DNA ଅଟେ, ତେବେ ପ୍ରଥମଟି ବାଛନ୍ତୁ, ଯାହା ଜିନ୍ ର ଜେନୋମିକ୍ DNA କ୍ରମ |
(2) ଯଦି ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମ mRNA ଅଟେ, ଦ୍ୱିତୀୟଟି ଚୟନ କରନ୍ତୁ |ପ୍ରବେଶ କରିବା ପରେ, ନିମ୍ନ ସାରଣୀରେ “CDS” କ୍ଲିକ୍ କରନ୍ତୁ |ବ୍ରାଉନ୍ ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ୍ କ୍ରମ ହେଉଛି ଜିନ୍ ର କୋଡିଂ କ୍ରମ |
03 ଡିଜାଇନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ |
Primer-BLAST ଇଣ୍ଟରଫେସ୍ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତୁ |
ଜିନ୍ କ୍ରମ ସଂଖ୍ୟା କିମ୍ବା ଉପର ବାମ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଫାସ୍ତା ଫର୍ମାଟରେ କ୍ରମ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ସମ୍ପୃକ୍ତ ପାରାମିଟରଗୁଡିକ ପୁରଣ କରନ୍ତୁ |

“ପ୍ରାଇମର୍ ପାଅ” କ୍ଲିକ୍ କର ଏବଂ NCBI ପପ୍ ଅପ୍ ହେବ ଯାହା ତୁମକୁ କହିବ ଯେ ଏହିପରି ପାରାମିଟର ଚୟନ ଅନ୍ୟ ବିଭାଜନ ପ୍ରକାରରେ ବୃଦ୍ଧି ହେବ |ଆମେ ବିଭିନ୍ନ ସ୍ପ୍ଲାଇସିଙ୍ଗ୍ ପ୍ରକାରଗୁଡିକ ଯାଞ୍ଚ କରିପାରିବା ଏବଂ ଉପଯୁକ୍ତ ପ୍ରାଇମର୍ ଯୋଡି ପାଇବା ପାଇଁ ସେଗୁଡିକୁ ଦାଖଲ କରିପାରିବା (ନିମ୍ନ ଚିତ୍ରରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି) |ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ଚାଲିବା ପାଇଁ ଦଶ ସେକେଣ୍ଡ ସମୟ ନେଇପାରେ |
ଏହି ପ୍ରାଥମିକ ଯୋଡିଗୁଡ଼ିକର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ପ୍ରାୟ 60 ° C |ପରୀକ୍ଷଣର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ଅନୁଯାୟୀ, ମଧ୍ୟମ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ, ଭଲ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ଗୁଡ଼ିକର କମ୍ ଆତ୍ମ-ସଂପନ୍ନତା ସହିତ ପ୍ରାଇମର୍ ବାଛନ୍ତୁ, ଏବଂ ସଫଳତା ହାର ବହୁତ ଅଧିକ!
04 ପ୍ରାଥମିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଯାଞ୍ଚ |
ବାସ୍ତବରେ, ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ସହିତ, ପ୍ରାଇମର୍-ବ୍ଲାଷ୍ଟ ମଧ୍ୟ ଆମେ ନିଜେ ଡିଜାଇନ୍ କରିଥିବା ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିପାରିବ |ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ପୃଷ୍ଠାକୁ ଫେରନ୍ତୁ, ଆମେ ଡିଜାଇନ୍ କରିଥିବା ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପାରାମିଟରଗୁଡିକ ସଜାଡିବ ନାହିଁ |ଦାଖଲ କରିବା ପରେ, ଆପଣ ଦେଖିପାରିବେ ଯେ ପ୍ରାଇମର ଯୋଡି ଅନ୍ୟ ଜିନ୍ ଉପରେ ମଧ୍ୟ ଅଛି କି?ଯଦି ଏହି ସମସ୍ତ ଜିନ୍ ଉପରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୁଏ ଆମେ ବ pl ାଇବାକୁ ଚାହୁଁଛୁ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଏହି ଯୁଗଳ ପ୍ରାଇମରର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବହୁତ ଭଲ!(ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଏହା ହେଉଛି ପ୍ରାଥମିକ ପ୍ରଶ୍ନର ଏକମାତ୍ର ଫଳାଫଳ!)

05 ପ୍ରାଥମିକ ଗୁଣାତ୍ମକ ବିଚାର |
କେଉଁ ପ୍ରକାରର ପ୍ରାଇମର୍ ହେଉଛି “ପରଫେକ୍ଟ” ପ୍ରାଇମର୍ ଯାହା “ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଦକ୍ଷତା”, “ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦ ବ characteristics ଶିଷ୍ଟ୍ୟ” ଏବଂ “ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ” କୁ ଏକତ୍ର କରେ |
ବୃଦ୍ଧି ଦକ୍ଷତା |

ତରଳିବା ବକ୍ର
ପ୍ରାଥମିକମାନଙ୍କର ଏମ୍ପ୍ଲାଇସିଙ୍ଗ୍ ଦକ୍ଷତା 90% -110% ରେ ପହ reaches ୍ଚେ, ଯାହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଦକ୍ଷତା ଭଲ, ଏବଂ ତରଳିବା ବକ୍ରର ଏକ ଶିଖର ଏବଂ ସାଧାରଣତ T Tm> 80 ° C, ଯାହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ଏମ୍ପ୍ଲାଇସିଫିକେସନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଭଲ |
 
ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଉତ୍ପାଦ:
ପ୍ରକୃତ ସମୟ PCR ସହଜ - SYBR ଗ୍ରୀନ୍ I |
ରିଅଲ୍ ଟାଇମ୍ PCR ସହଜ-ଟକମ୍ୟାନ୍ |