ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପରିମାଣିକ PCR ର Ct ମୂଲ୍ୟ ହେଉଛି ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଫଳାଫଳ ଉପସ୍ଥାପନା ଫର୍ମ |ଜିନ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ କିମ୍ବା ଜିନ୍ କପି ସଂଖ୍ୟା ଗଣିବା ପାଇଁ ଏହା ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |ତେବେ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣର Ct ମୂଲ୍ୟ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଏ କି?Ct ମୂଲ୍ୟର ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ପରିସର କିପରି ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବେ?
Ct ମୂଲ୍ୟ କ’ଣ?
QPCR ବିସ୍ତାରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ, ସଂପୃକ୍ତ ସଂଖ୍ୟାର ବର୍ଦ୍ଧନ ଚକ୍ର (ଚକ୍ର ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ) ଯେତେବେଳେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦ୍ରବ୍ୟର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସଙ୍କେତ ସେଟ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୀମାକୁ ପହଞ୍ଚେ |C ଚକ୍ର ପାଇଁ ଏବଂ T ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ପାଇଁ |ସରଳ ଭାବରେ କହିବାକୁ ଗଲେ, Ct ମୂଲ୍ୟ ହେଉଛି ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା, ଯେତେବେଳେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ qPCR ରେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦରେ ପହଞ୍ଚେ |ତଥାକଥିତ “ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦ” ପରେ ଅଧିକ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯିବ |
Ct ମୂଲ୍ୟ କ’ଣ କରେ?
1. ଏକ୍ସପେନ୍ସିନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍, ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପରିମାଣ ଏବଂ Ct ମୂଲ୍ୟ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କ |
ଆଦର୍ଶରେ, qPCR ରେ ଜିନ୍ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟକ ଚକ୍ର ପରେ ଏକ୍ସପୋନ୍ସନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଜମା ହୋଇଥାଏ |ବର୍ଦ୍ଧିତ ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଉତ୍ପାଦ ପରିମାଣ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କ ହେଉଛି: ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦ ପରିମାଣ = ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପରିମାଣ × (1 + En) ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା |ତଥାପି, qPCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସର୍ବଦା ଏକ ଆଦର୍ଶ ପରିସ୍ଥିତିରେ ନଥାଏ |ଯେତେବେଳେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ଏକ “ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉତ୍ପାଦ ପରିମାଣ” ରେ ପହଞ୍ଚେ, ଏହି ସମୟରେ ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ହେଉଛି Ct ମୂଲ୍ୟ, ଏବଂ ଏହା ଏକ୍ସପେନ୍ସନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଅବଧିରେ |Ct ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ଆରମ୍ଭ ଟେମ୍ପଲେଟର ପରିମାଣ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କ: ଟେମ୍ପଲେଟର Ct ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କପି ନମ୍ବରର ଲୋଗାରିଦମ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ର ar ଖ୍ୟ ସମ୍ପର୍କ ଅଛି |ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଯେତେ ଅଧିକ, Ct ମୂଲ୍ୟ ଛୋଟ;ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏକାଗ୍ରତା କମ୍, Ct ମୂଲ୍ୟ ଅଧିକ |
2. ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ବକ୍ର, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୀମା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ PCR ଉତ୍ପାଦ ପରିମାଣ |
QPCR ଆମ୍ଲିଫିକେସନ୍ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ସିଧାସଳଖ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ଆକାରରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୁଏ, ଅର୍ଥାତ୍ ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ବକ୍ର |PCR ର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ବିସ୍ତାରଣ ଆଦର୍ଶ ଅବସ୍ଥାରେ ଅଛି, ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ଅଳ୍ପ, ଉତ୍ପାଦ ସଂଗ୍ରହ କମ୍, ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସ୍ତରକୁ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପୃଷ୍ଠଭୂମିରୁ ସ୍ପଷ୍ଟ ଭାବରେ ପୃଥକ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ |ଏହା ପରେ, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ବ increases ି ଏକ୍ସପେନ୍ସିନାଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପ୍ରବେଶ କରେ |PCR ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରେ ଯେତେବେଳେ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କେବଳ ଏକ୍ସପୋନ୍ସନାଲ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଥାଏ, ଯାହା “ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦ” ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଏଥିରୁ କଟାଯାଇପାରିବ |ତେଣୁ, ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିମାଣର ଉତ୍ପାଦ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସିଗ୍ନାଲ୍ ତୀବ୍ରତା ହେଉଛି ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୀମା |
PCR ର ଶେଷ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ବକ୍ର ଆଉ ଏକ୍ସପେନ୍ସିନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଦେଖାଏ ନାହିଁ, ଏବଂ ର ar ଖିକ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଏବଂ ମାଳଭୂମି ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପ୍ରବେଶ କରେ |
3. Ct ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପୁନ oduc ପ୍ରବୃତ୍ତି |
ଯେତେବେଳେ PCR ଚକ୍ର Ct ମୂଲ୍ୟର ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟାରେ ପହଞ୍ଚେ, ଏହା ପ୍ରକୃତ ଏକ୍ସପେନ୍ସିନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଅବଧିରେ ପ୍ରବେଶ କରିଛି |ଏହି ସମୟରେ, ଛୋଟ ତ୍ରୁଟି ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇ ନାହିଁ, ତେଣୁ Ct ମୂଲ୍ୟର ପୁନ oduc ପ୍ରବୃତ୍ତି ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ଅଟେ, ଅର୍ଥାତ୍ ସମାନ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ କିମ୍ବା ବିଭିନ୍ନ ଟ୍ୟୁବରେ ଏକ ସମୟରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥାଏ |ବୃଦ୍ଧି, ପ୍ରାପ୍ତ Ct ମୂଲ୍ୟ ସ୍ଥିର ଅଟେ |
1. ବୃଦ୍ଧି ଦକ୍ଷତା En
PCR ଆମ୍ଲିଫିକେସନ୍ ଦକ୍ଷତା ସେହି କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତାକୁ ବୁ refers ାଏ ଯାହା ସହିତ ପଲିମେରେଜ୍ ଜିନ୍ କୁ ଏକ ଆମ୍ପଲିକନ୍ରେ ବ ified ାଇଥାଏ |ଯେତେବେଳେ ଗୋଟିଏ DNA ଅଣୁ ଦୁଇଟି DNA ଅଣୁରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୁଏ, ବିସ୍ତାର କ୍ଷମତା 100% ଅଟେ |ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା ସାଧାରଣତ En En ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥାଏ |ପରବର୍ତ୍ତୀ ଆର୍ଟିକିଲଗୁଡିକର ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ସହଜ କରିବାକୁ, ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଉଥିବା କାରକଗୁଡିକ ସଂକ୍ଷେପରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୁଏ |
| ପ୍ରଭାବ କାରକ | ବ୍ୟାଖ୍ୟା | କିପରି ବିଚାର କରିବେ? |
| A. PCR ନିଷ୍କ୍ରିୟକାରୀ | | 1. ଟେମ୍ପଲେଟ୍ DNA ରେ ପଦାର୍ଥ ଥାଏ ଯାହାକି PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ, ଯେପରିକି ପ୍ରୋଟିନ୍ କିମ୍ବା ଡିଟରଜେଣ୍ଟ୍ |2. ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପରେ cDNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ RNA କିମ୍ବା RT ରେଜେଣ୍ଟ୍ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ଏକ ଉଚ୍ଚ ଏକାଗ୍ରତା ଧାରଣ କରିଥାଏ, ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ମଧ୍ୟ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କରିପାରେ | | 1. A260 / A280 ଏବଂ A260 / A230 କିମ୍ବା RNA ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଅନୁପାତ ମାପ କରି ପ୍ରଦୂଷଣ ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ବିଚାର କରାଯାଇପାରିବ |2. ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପରେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅନୁପାତ ଅନୁଯାୟୀ cDNA ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ | |
| B. ଅନୁପଯୁକ୍ତ ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ | | ପ୍ରାଥମିକମାନେ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ଆନ୍ନା କରନ୍ତି ନାହିଁ | | ପ୍ରାଇମର୍-ଡାଇମର୍ କିମ୍ବା ହେୟାରପିନ, ମେଳ ଖାଉ ନଥିବା ଏବଂ ବେଳେବେଳେ ଇଣ୍ଟ୍ରୋନିକ୍ ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ | |
| C. ଅନୁପଯୁକ୍ତ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରୋଗ୍ରାମ ଡିଜାଇନ୍ | | 1. ପ୍ରାଥମିକମାନେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ଆନ୍ନାଲ୍ କରିପାରିବେ ନାହିଁ |2. ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ର ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ମୁକ୍ତି | 3. ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା DNA ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ହ୍ରାସ ପାଇଲା | | 1. ଆନିଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ପ୍ରାଇମରର ଟିଏମ୍ ମୂଲ୍ୟଠାରୁ ଅଧିକ |2. ପ୍ରି-ଡେନାଟ୍ରେସନ୍ ସମୟ ବହୁତ କମ୍ ଅଟେ | 3. ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରକ୍ରିୟାର ପ୍ରତ୍ୟେକ ପର୍ଯ୍ୟାୟର ସମୟ ବହୁତ ଲମ୍ବା ଅଟେ | |
| D. ରେଜେଣ୍ଟସ୍ କିମ୍ବା ପାଇପେଟିଂ ତ୍ରୁଟିର ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ମିଶ୍ରଣ | | ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀରେ, PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ସ୍ଥାନୀୟ ଏକାଗ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ କିମ୍ବା ଅସମାନ, ଫଳସ୍ୱରୂପ PCR ବିସ୍ତାରର ଅଣ-ଏକ୍ସପେନ୍ସିନାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ | | |
| E. ଆମ୍ପଲିକନ୍ ଲମ୍ବ | | ଆମ୍ପଲିକନ୍ ର ଲମ୍ବ ବହୁତ ଲମ୍ବା, 300bp ରୁ ଅଧିକ, ଏବଂ ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା କମ୍ ଅଟେ | | ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ ଯେ ଆମ୍ପଲିକନ୍ ଲମ୍ବ 80-300bp ମଧ୍ୟରେ ଅଛି | |
| F. qPCR ପୁନ ag ର ପ୍ରଭାବ | | ରିଜେଣ୍ଟରେ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ର ଏକାଗ୍ରତା କମ୍ କିମ୍ବା ବଫରରେ ଆୟନର ଏକାଗ୍ରତା ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ହୋଇନଥାଏ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଟାକ ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସର୍ବାଧିକରେ ପହଞ୍ଚି ନଥାଏ | | ମାନକ ବକ୍ର ଦ୍ୱାରା ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତାର ନିର୍ଣ୍ଣୟ | |
2. Ct ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିସର
Ct ମୂଲ୍ୟ 15-35 ରୁ ପରିସର ଅଟେ |ଯଦି Ct ମୂଲ୍ୟ 15 ରୁ କମ୍, ଏହା ବିବେଚନା କରାଯାଏ ଯେ ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ବେସ୍ ଲାଇନ୍ ଅବଧି ମଧ୍ୟରେ ଅଛି ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୀମା ପହଞ୍ଚି ନାହିଁ |ଆଦର୍ଶରେ, Ct ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କପି ନମ୍ବରର ଲୋଗାରିଦମ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ର ar ଖ୍ୟ ସମ୍ପର୍କ ଅଛି, ଅର୍ଥାତ୍ ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ବକ୍ର |ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ବକ୍ର ମାଧ୍ୟମରେ, ଯେତେବେଳେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା 100% ହୁଏ, ଜିନ୍ ର ଏକକ କପି ସଂଖ୍ୟା ପରିମାଣ ପାଇଁ ଗଣିତ Ct ମୂଲ୍ୟ ପ୍ରାୟ 35 ଅଟେ | ଯଦି ଏହା 35 ରୁ ଅଧିକ ହୁଏ, ଟେମ୍ପଲେଟର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ କପି ସଂଖ୍ୟା ତତ୍ତ୍ୱଗତ ଭାବରେ 1 ରୁ କମ୍, ଯାହା ଅର୍ଥହୀନ ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଇପାରେ |
ବିଭିନ୍ନ ଜିନ୍ Ct ରେଞ୍ଜ ପାଇଁ, ଜିନ୍ କପି ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପରିମାଣରେ ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତା ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ହେତୁ, ଜିନ୍ ପାଇଁ ଏକ ମାନକ ବକ୍ର ତିଆରି କରିବା ଏବଂ ଜିନ୍ ର ର ar ଖ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ ପରିସର ଗଣନା କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |
3. Ct ମୂଲ୍ୟର ପ୍ରଭାବ କାରକ |
ବର୍ଦ୍ଧିତ ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କରୁ: ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ = ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟର ପରିମାଣ × (1 + En) ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା, ଏହା ଦେଖାଯାଇପାରେ ଯେ ଆଦର୍ଶ ଅବସ୍ଥାରେ, ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏବଂ ଏନ୍ ପରିମାଣ Ct ମୂଲ୍ୟ ଉପରେ ନକାରାତ୍ମକ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ |ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଗୁଣବତ୍ତା କିମ୍ବା ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତାର ପାର୍ଥକ୍ୟ Ct ମୂଲ୍ୟକୁ ବହୁତ ବଡ କିମ୍ବା ବହୁତ ଛୋଟ କରିବ |
4.Ct ମୂଲ୍ୟ ବହୁତ ବଡ କିମ୍ବା ବହୁତ ଛୋଟ |
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ଫେବୃଆରୀ -22-2023 |
