ସମସ୍ତେ qRT-PCR ପରୀକ୍ଷଣ, ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍, ଫଳାଫଳ ବ୍ୟାଖ୍ୟା ଇତ୍ୟାଦିର ନୀତି ବିଷୟରେ କହୁଛନ୍ତି, କିନ୍ତୁ ମୁଁ ଭାବୁଛି ମୁଁ qRT-PCR ର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ କାର୍ଯ୍ୟ ତୁମ ସହିତ ବାଣ୍ଟିବା ଉଚିତ୍ |ଏହା ଛୋଟ, କିନ୍ତୁ ଏହା ଫଳାଫଳ ବିଷୟରେ |

QRT-PCR କରିବା ପୂର୍ବରୁ, ଆମର ନିଜସ୍ୱ RNA ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରଣାଳୀ ବିଷୟରେ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ବୁ understanding ିବା ଆବଶ୍ୟକ |ସର୍ବଶେଷରେ, ଆମର ପ୍ରୟାସ କେବଳ ଅଭ୍ୟାସ କରିବା ପରିବର୍ତ୍ତେ ଫଳାଫଳ ପାଇବାକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ରଖାଯାଇଛି |ତେଣୁ qRT-PCR କରିବା ପୂର୍ବରୁ, ଆମକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ସମସ୍ୟାଗୁଡିକ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ପଡିବ (ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ କେତେକ କେବଳ SYBR ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ) |

1 ତୁମେ ନିଶ୍ଚିତ କି ତୁମର RNA ଖରାପ ହୋଇନାହିଁ?

NanoDrop 2000 କେବଳ RNA ର ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ, କିନ୍ତୁ RNA ର ଅଖଣ୍ଡତା ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ନାହିଁ |

RNA (RNA Intesity Number) ମୂଲ୍ୟ RNA ର ଅଖଣ୍ଡତାକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିପାରିବ, ଯାହା ଆଜିଲିଣ୍ଟ 2100 ବାୟୋନାଲିଜର ସିଷ୍ଟମ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥାଏ |

ବିଭିନ୍ନ RNA ନମୁନା (ଇଉକାରିଓଟ୍) ପାଇଁ RIN ମୂଲ୍ୟର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଚିତ୍ର |

ତଥାପି, ଲାବ୍ରୋଟୋରୀରେ ସାଧାରଣତ Ag Agilent 2100 Bioanalyzer ନାହିଁ |ଏହି ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ, ଆମେ ଫର୍ମାଲଡିହାଇଡ୍ ଜେଲ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବା, କିନ୍ତୁ ମୋଟ RNA ର ଆବଶ୍ୟକତା ଅଧିକ, ତେଣୁ ସାଧାରଣ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ପାଇଁ ଦ୍ରୁତତମ ପଦ୍ଧତି |ଏହା ଏକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ ପରିବେଶରେ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ, ତେଣୁ DEPC ପାଣି ସହିତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଟ୍ୟାଙ୍କ, ସୋଲ୍ ବୋତଲ, ଜେଲ୍ ବ୍ରାକେଟ୍ ଏବଂ କମ୍କୁ ଧୋଇବା ଆବଶ୍ୟକ |ଆଗରୋଜ୍ ମଧ୍ୟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ (ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏହା ସତେଜ ଭାବରେ ଖୋଲାଯାଏ), ଏବଂ ଲୋଡିଂ ବଫର୍ ଯଥାସମ୍ଭବ ତାଜା ହେବା ଉଚିତ୍, 1.2% ଜେଲ୍ ସହିତ |

ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ ଯେ ଜେଲ୍ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ, ନଚେତ୍ ଏହା ଅମାନୁଷିକ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ସୃଷ୍ଟି କରିବ, ଚିତ୍ର 9 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି |ଯଦି ଭୋଲଟେଜ୍ ଅତ୍ୟଧିକ ଅଧିକ କିମ୍ବା ଅଧିକ ସମୟ ଚାଲିବା ଦ୍ heat ାରା ଉତ୍ତାପ ସୃଷ୍ଟି ହେବ ଏବଂ RNA ଅବନତି ଘଟିବ, ତେଣୁ ଭୋଲ୍ଟେଜ୍ ଏବଂ ସମୟକୁ ଯଥାର୍ଥ ଭାବରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯିବା ଉଚିତ |ଏଥିସହ, ନମୁନାରେ DNA ଅବଶିଷ୍ଟ ଅଛି କି ନାହିଁ, ଏବଂ ଜେଲ୍ ଚାଲିବା ମଧ୍ୟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିପାରିବ ଏବଂ ବିତରଣ କୂଅରେ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ରଖାଯାଇଥିବା ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ମଧ୍ୟ ଜାଣିପାରିବେ |

ଚିତ୍ରRNA ର ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଚିହ୍ନଟ |

2 ତୁମର cDNA ର ଏକାଗ୍ରତା ବିଷୟରେ ତୁମେ ନିଶ୍ଚିତ କି?

ଲାବୋରେଟୋରୀରେ ବଡ ଭାଇମାନଙ୍କ ଅଭିଜ୍ଞତା ହେଉଛି ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ବିପରୀତ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ 20 ଉଲ୍ ସିଷ୍ଟମର ସିଡିଏନ୍ଏ ସିଧାସଳଖ 20X ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିବାବେଳେ ଡକ୍ଟରାଲ୍ ପୋଷ୍ଟ ଭଉଣୀମାନେ 10X ମିଶ୍ରିତ |ମୁଁ ସାଧାରଣତ the ପରିସ୍ଥିତି ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ |କାରଣ ପ୍ରତ୍ୟେକ ବ୍ୟକ୍ତିଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଥିବା ଆରଏନଏର ଗୁଣ ଭିନ୍ନ, ଓଲଟା ସ୍ତର ମଧ୍ୟ ଭିନ୍ନ, ଏବଂ ଓଲଟା ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ସ୍ଥିର ହୋଇନପାରେ |

ତେଣୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଥର ଯେତେବେଳେ ମୁଁ ଓଲଟା ସିଡିଏନ୍ଏ ପାଇବି, ମୁଁ ପ୍ରଥମେ ଏହାକୁ ପ୍ରାୟ 3 ଥର ମିଶ୍ରିତ କରିବି, ଏବଂ ତା’ପରେ ଆରଟି- PCR କରିବା ପାଇଁ ଗୃହରକ୍ଷୀ ଜିନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବି, ଚକ୍ରର ସଂଖ୍ୟା ସାଧାରଣତ 25 25 ଚକ୍ର ଅଟେ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏକାଗ୍ରତା ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ, ଏବଂ ତା’ପରେ ଅନ୍ତିମ ବିସ୍ତାର କାରକ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ |

3 ତୁମର ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସହଜ ବୋଲି ଆପଣ ନିଶ୍ଚିତ କି?

ଏହା qRT-PCR ର ତରଳିବା ବକ୍ର ପାସ୍ କରିପାରିବ, କିନ୍ତୁ ଏଥିପାଇଁ ଟଙ୍କା ଖର୍ଚ୍ଚ ହୁଏ |ପ୍ରଚୁର ଅର୍ଥ ବିନା ଲାବୋରେଟୋରୀଗୁଡିକ ପାଇଁ, ଯେତେବେଳେ ସେମାନେ ବହୁ ପ୍ରାଇମର୍ ପାଆନ୍ତି, ସେମାନେ ସାଧାରଣ RT-PCR ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବେ ଯେ ଏହା ଏକକ ବ୍ୟାଣ୍ଡ କି ନାହିଁ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଚିହ୍ନଟ କରେ |ଯଦି ଲାବୋରେଟୋରୀ ଅର୍ଥର ଅଭାବ ନଥାଏ, ତେବେ ସମସ୍ତ ପ୍ରାଇମରର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ତରଳିବା ବକ୍ର ମାଧ୍ୟମରେ ଥରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ |

4 ତୁମର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅବସ୍ଥା ଉପଯୁକ୍ତ ବୋଲି ଆପଣ ନିଶ୍ଚିତ କି?

SYBR କୁ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଆଲୋକରୁ ସୁରକ୍ଷିତ କରାଯିବା ଉଚିତ, ତେଣୁ SYBR ରେଜେଣ୍ଟ୍ ଯୋଡିବା ସମୟରେ ଓଭରହେଡ୍ ଲାଇଟ୍ ବନ୍ଦ କରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ଏହାକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କରିବା ପାଇଁ କେବଳ ଅନ୍ଧକାର ଆଲୋକ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |

SYBR କୁ 4 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ କରନ୍ତୁ |ବ୍ୟବହାର ସମୟରେ, ଫୋମିଙ୍ଗକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶ୍ରଣ କରିବା ପାଇଁ ଧୀରେ ଧୀରେ ଉପର ଏବଂ ତଳକୁ ଓଲଟାଇ ଦିଅନ୍ତୁ, ଏବଂ ଜୋରରେ ଭର୍ଟେକ୍ସ କରନ୍ତୁ ନାହିଁ |

କିଛି ସାନ ଭଉଣୀ ନମୁନା ମିଶ୍ରଣ ଭୟରେ PCR ବୋର୍ଡରେ ମାର୍କ ଆଙ୍କିବାକୁ ପସନ୍ଦ କରନ୍ତି, ଯାହା ଭୁଲ ଅଟେ |କାରଣ ଆପଣଙ୍କର ମାର୍କରଗୁଡିକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ସଂଗ୍ରହକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିବାର ସମ୍ଭାବନା ଅଧିକ, ମୁଁ ସାଧାରଣତ j ଜୁନିଅର୍ମାନଙ୍କୁ ସ୍ମୃତିରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିବା ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ନୋଟବୁକ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥାଏ, ଯେପରି ନିମ୍ନରେ ଦେଖାଯାଇଛି |

ଚିତ୍ରqRT-PCR ନମୁନା ଲୋଡିଂ ଚିତ୍ର |

5 ଆପଣ ନିଶ୍ଚିତ କି ଆପଣ ଏହାକୁ ଠିକ୍ କରୁଛନ୍ତି?

ଗ୍ଲୋଭସ୍ ପିନ୍ଧିବା, ଗ୍ଲୋଭସ୍ ପିନ୍ଧିବା, ଗ୍ଲୋଭସ୍ ପିନ୍ଧିବା ଏବଂ ତିନିଥର ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା କହିବା ନିଶ୍ଚିତ ହୁଅନ୍ତୁ |

SYBR ର ଆଲୋକକୁ ଆଲୋକରେ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ, ମୁଁ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ପ୍ରଥମେ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଯୋଡିବାକୁ ପସନ୍ଦ କରେ, ଯେପରି ନିମ୍ନ ଚିତ୍ରରେ ଦେଖାଯାଇଛି |ଅଭିଜ୍ଞତା ଅନୁଯାୟୀ, ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଯୋଗ କଲେ ନମୁନା ତ୍ରୁଟି ହେବାର ସମ୍ଭାବନା ଥାଏ |ତେଣୁ, ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଯୋଗକରି ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ତ୍ରୁଟିକୁ କମ୍ କରିବାକୁ, ମୁଁ ସାଧାରଣତ again ପୁନର୍ବାର ନମୁନାକୁ ଦ୍ୱିଗୁଣିତ କରେ, ଏବଂ H2O2 ର ପରିମାଣକୁ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ନମୁନା ଯୋଡିବା ସମୟରେ ଦୁଇଗୁଣ କରେ |

ଚିତ୍ରQRT-PCR ଲୋଡିଙ୍ଗର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଚିତ୍ର |

ତାପରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ qRT-PCR ସିଷ୍ଟମକୁ ବିନ୍ୟାସ କରନ୍ତୁ |

ଚିତ୍ରqRT-PCR ସିଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତି ଚିତ୍ର |

ଟିପ୍ପଣୀ: ବରଫ ଉପରେ ବିନ୍ୟାସ ପ୍ରକ୍ରିୟା କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |

ନମୁନା ଯୋଡିବା ପରେ, ସ୍ୱଚ୍ଛ ସିଲ୍ ଫିଲ୍ମ ଲେପନ କରନ୍ତୁ |ନିଜ ହାତରେ ସ୍ୱଚ୍ଛ ସିଲ୍ ଫିଲ୍ମର ପୃଷ୍ଠକୁ ସ୍ପର୍ଶ ନକରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ, କେବଳ ଫିଲ୍ମର ଉଭୟ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଥିବା ସ୍ଥାନରୁ କାର୍ଯ୍ୟ କରନ୍ତୁ |କାରଣ ଫିଙ୍ଗର ପ୍ରିଣ୍ଟ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ସଂଗ୍ରହକୁ ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବିତ କରିପାରେ |ତା’ପରେ ନମୁନାକୁ କାନ୍ଥରେ ଟାଙ୍ଗିବାକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ସ୍ୱଳ୍ପ ବେଗରେ 10 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ଶୀଘ୍ର ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |

ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଉତ୍ପାଦ:

ସେଲ୍ ସିଧାସଳଖ RT-qPCR କିଟ୍ |

RT ସହଜ II |