ଲାବୋରେଟୋରୀରେ ଏକ ନୂତନ ଭାବରେ, କମ୍ ରୂପାନ୍ତର ହାର ସହିତ ଏକ ଗଛରୁ ସକରାତ୍ମକ ଉଦ୍ଭିଦଗୁଡିକୁ ସ୍କ୍ରିନ କରିବା ଭଲ କାମ ନୁହେଁ |ପ୍ରଥମେ, ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ନମୁନାରୁ ଗୋଟିଏ ପରେ ଗୋଟିଏ DNA ବାହାର କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ପରେ PCR ଦ୍ୱାରା ବିଦେଶୀ ଜିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ହେବ |ତଥାପି, ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ପ୍ରାୟତ blan କିଛି ଆଇଟମ୍ ସହିତ ଖାଲି ଏବଂ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଅଟେ, କିନ୍ତୁ ମିସ୍ ଚିହ୍ନଟ କିମ୍ବା ମିଥ୍ୟା ଚିହ୍ନଟ ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ସ୍ଥିର କରିବା ଅସମ୍ଭବ |।ଏହିପରି ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଏବଂ ଫଳାଫଳକୁ ସାମ୍ନା କରିବା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଅସହାୟ କି?ବ୍ୟସ୍ତ ହୁଅନ୍ତୁ ନାହିଁ, ଭାଇ ଆପଣଙ୍କୁ ଟ୍ରାନ୍ସଜେନିକ୍ ପଜିଟିଭ୍ ପ୍ଲାଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ କିପରି ସହଜ ଏବଂ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ସ୍କ୍ରିନ କରିବେ ଶିଖାନ୍ତି |

ପଦାଙ୍କ 1

ଡିଜାଇନ୍ ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରାଥମିକତା |

ପରୀକ୍ଷା ହେବାକୁ ଥିବା ନମୁନା ଅନୁଯାୟୀ ଚିହ୍ନଟ ହେବାକୁ ଥିବା ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ଏବଂ ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍ରେ ଏକ ପ୍ରତିନିଧୀ 100-500bp କ୍ରମ ଚୟନ କରନ୍ତୁ |ଭଲ ପ୍ରାଥମିକତା ଚିହ୍ନଟ ଫଳାଫଳର ସଠିକତାକୁ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିପାରେ ଏବଂ ଚିହ୍ନଟ ସମୟକୁ ଛୋଟ କରିପାରେ (ସାଧାରଣତ used ବ୍ୟବହୃତ ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରାଥମିକତା ପାଇଁ ପରିଶିଷ୍ଟକୁ ଦେଖନ୍ତୁ)

ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ: ନୂତନ ଭାବରେ ପରିକଳ୍ପିତ ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅବସ୍ଥାକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରିବା ଏବଂ ବଡ଼ ଆକାରର ଚିହ୍ନଟ ପୂର୍ବରୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ସଠିକତା, ସଠିକତା ଏବଂ ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ଯାଞ୍ଚ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |

ପଦାଙ୍କ 2

ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଡିଜାଇନ୍ କରନ୍ତୁ |

ସକରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ: PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ଏବଂ ଅବସ୍ଥା ସ୍ୱାଭାବିକ କି ନାହିଁ ତାହା ସ୍ଥିର କରିବାକୁ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଖଣ୍ଡ ଧାରଣ କରିଥିବା ଶୁଦ୍ଧ DNA ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |

ନକାରାତ୍ମକ / ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ: DNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ କିମ୍ବା ddH2O ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଯାହା PCR ସିଷ୍ଟମରେ ପ୍ରଦୂଷଣର ଉତ୍ସ ଅଛି କି ନାହିଁ ଜାଣିବା ପାଇଁ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଖଣ୍ଡକୁ ଧାରଣ କରେ ନାହିଁ |

ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍: PCR ଦ୍ୱାରା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହାର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବାକୁ ନମୁନାର ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପ୍ରାଇମର୍ / ପ୍ରୋବ ମିଶ୍ରଣକୁ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |

ବିଜ୍ଞପ୍ତି:

ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳର ବ ity ଧତାକୁ ଆକଳନ କରିବାକୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ ସକରାତ୍ମକ, ନକାରାତ୍ମକ / ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସେଟ୍ କରାଯିବା ଉଚିତ |

ପରୀକ୍ଷଣ ପ୍ରସ୍ତୁତି |

ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ, ସମାଧାନ ସମାନ ଭାବରେ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ ଦେଖନ୍ତୁ |ଯଦି ବୃଷ୍ଟିପାତ ମିଳେ, ଏହାକୁ ବ୍ୟବହାର କରିବା ପୂର୍ବରୁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ଏହାକୁ ତରଳାଇ ମିଶ୍ରଣ କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ |ଅସମାନ ଆୟନ ବଣ୍ଟନକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ 2 × PCR ମିଶ୍ରଣକୁ ପାଇପେଟ୍ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋପିପେଟ୍ ସହିତ ବାରମ୍ବାର ମିଶ୍ରଣ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |

ବିଜ୍ଞପ୍ତି:

ମାନୁଆଲ୍ ବାହାର କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଏହାକୁ ଭଲଭାବେ ପ read ନ୍ତୁ, ଏବଂ ମାନୁଆଲ୍ ର ଆବଶ୍ୟକତା ଅନୁଯାୟୀ କଡା ପରୀକ୍ଷଣ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରସ୍ତୁତି କରନ୍ତୁ |

ପଦାଙ୍କ 4

PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରନ୍ତୁ |

ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ, ପ୍ରାଇମର୍, H2O, ଏବଂ 2 × PCR ମିଶ୍ରଣକୁ ସମାନ ଭାବରେ ମିଶାନ୍ତୁ, ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଟ୍ୟୁବରେ ବଣ୍ଟନ କରନ୍ତୁ |

ବିଜ୍ଞପ୍ତି:

ବୃହତ-ମାପ କିମ୍ବା ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, UNG ଏନଜାଇମ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି, ଯାହା PCR ଉତ୍ପାଦ ଦ୍ caused ାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଏରୋସୋଲ୍ ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ଏଡାଇ ଦେଇପାରେ |

ପଦାଙ୍କ 5

ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ |

ସିଧାସଳଖ PCR ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ବ୍ୟବହାର କରି, କ୍ଲାନ୍ତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ବିଶୋଧନ ପ୍ରକ୍ରିୟାର କ is ଣସି ଆବଶ୍ୟକତା ନାହିଁ, ନମୁନା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ 10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ ହୋଇପାରିବ ଏବଂ ସଂପୃକ୍ତ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |

ବିଜ୍ଞପ୍ତି:

କ୍ଲିଭେଜ୍ ପଦ୍ଧତିର ଉତ୍ତମ ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରଭାବ ଅଛି, ଏବଂ ପ୍ରାପ୍ତ ଉତ୍ପାଦକୁ ଏକାଧିକ ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |

5.1: ପତ୍ରର ସିଧାସଳଖ ବିସ୍ତାର |

ମାନୁଆଲରେ ଥିବା ଚିତ୍ରର ଆକାର ଅନୁଯାୟୀ, ପତ୍ର ଟିସୁକୁ 2-3 ମିମି ବ୍ୟାସ ସହିତ କାଟି PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସିଷ୍ଟମରେ ରଖନ୍ତୁ |

ଟିପନ୍ତୁ: ନିଶ୍ଚିତ କରନ୍ତୁ ଯେ ପତ୍ରର ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନରେ ସମ୍ପୁର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ବୁଡି ରହିଛି, ଏବଂ ଅଧିକ ପତ୍ର ଟିସୁ ଯୋଗ କରନ୍ତୁ ନାହିଁ |

5.2: ପତ୍ର ବିଭାଜନ ପଦ୍ଧତି |

5-7 ମିମି ବ୍ୟାସ ବିଶିଷ୍ଟ ପତ୍ର ଟିସୁକୁ କାଟି ଏକ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ରଖନ୍ତୁ |ଯଦି ଆପଣ ପରିପକ୍ୱ ପତ୍ର ବାଛିଛନ୍ତି, ଦୟାକରି ପତ୍ରର ମୁଖ୍ୟ ଶିରାର ଟିସୁ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଠାରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |ପାଇପେଟ୍ 50ul ବଫର୍ P1 ଲାଇସେଟ୍ ଏକ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ନିଶ୍ଚିତ କରେ ଯେ ଲାଇସେଟ୍ ପତ୍ରର ଟିସୁକୁ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ବୁଡ଼ାଇ ପାରିବ, ଏହାକୁ ଥର୍ମାଲ୍ ସାଇକ୍ଲର୍ କିମ୍ବା ଧାତୁ ସ୍ନାନରେ ରଖିବ ଏବଂ 5-10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95 ° C ରେ ଲାଇସ୍ କରିବ |

50ul ବଫର୍ P2 ନିରପେକ୍ଷତା ସମାଧାନ ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶାନ୍ତୁ |ଫଳସ୍ୱରୂପ ଲାଇସେଟ୍ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ ଏବଂ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସିଷ୍ଟମରେ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରେ |

ଟିପନ୍ତୁ: ଟେମ୍ପଲେଟର ପରିମାଣ PCR ସିଷ୍ଟମର 5-10% ମଧ୍ୟରେ ଅଛି, ଏବଂ ଏହା 20% ରୁ ଅଧିକ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ (ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, 20μl PCR ସିଷ୍ଟମରେ, 1-2μl ଲାଇସିସ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ, 4μl ରୁ ଅଧିକ ନୁହେଁ) |

ପଦାଙ୍କ 6

PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା |

PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଟ୍ୟୁବ୍କୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରିବା ପରେ, ଏହାକୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଁ ଏକ PCR ଯନ୍ତ୍ରରେ ରଖାଯାଏ |

ବିଜ୍ଞପ୍ତି:

ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବିସ୍ତାର ପାଇଁ ଅଣ-ଶୁଦ୍ଧ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରେ, ତେଣୁ ଶୁଦ୍ଧ DNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଅପେକ୍ଷା ବର୍ଦ୍ଧିତ ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା 5-10 ଅଧିକ ଚକ୍ର ଅଟେ |

ପଦାଙ୍କ 7

ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ଫଳାଫଳ ବିଶ୍ଳେଷଣ |

M: 100bp DNA ଲେଡର୍ |

1 \ 4: ଶୁଦ୍ଧ DNA ପଦ୍ଧତି |

2 \ 5: ସିଧାସଳଖ PCR ପଦ୍ଧତି |

3 \ 6: ଖାଲି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ |

QC:

ପରୀକ୍ଷଣରେ ସେଟ୍ ହୋଇଥିବା ବିଭିନ୍ନ ନିୟନ୍ତ୍ରଣଗୁଡିକର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ନିମ୍ନଲିଖିତ ସର୍ତ୍ତଗୁଡିକ ପୂରଣ କରିବା ଉଚିତ୍ |ଅନ୍ୟଥା, ସମସ୍ୟାର କାରଣ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯିବା ଉଚିତ ଏବଂ ସମସ୍ୟା ଦୂର ହେବା ପରେ ପୁନର୍ବାର ପରୀକ୍ଷା କରାଯିବା ଉଚିତ୍ |

ସାରଣୀ 1. ବିଭିନ୍ନ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀର ସାଧାରଣ ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ |

* ଯେତେବେଳେ ପ୍ଲାସିମ୍ ଏକ ସକରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ନକାରାତ୍ମକ ହୋଇପାରେ |

ଫଳାଫଳ ବିଚାର:

ଉ: ନମୁନାର ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ନକାରାତ୍ମକ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସାଧାରଣ PCR ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ DNA ନମୁନାରୁ ବାହାର କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ କିମ୍ବା ବାହାର କରାଯାଇଥିବା DNA ରେ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନିରୋଧକ ଥାଏ, ଏବଂ DNA ପୁନର୍ବାର ବାହାର କରାଯିବା ଉଚିତ |

B. ନମୁନାର ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ସକରାତ୍ମକ, ଏବଂ ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ନକାରାତ୍ମକ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ନମୁନାରୁ ସାଧାରଣ PCR ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ DNA ବାହାର କରାଯାଇଥାଏ, ଏବଂ ଏହା ବିଚାର କରାଯାଇପାରେ ଯେ ନମୁନାରେ XXX ଜିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନାହିଁ |

C. ନମୁନାର ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ସକରାତ୍ମକ, ଏବଂ ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ଜିନ୍ ର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ ସକରାତ୍ମକ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ନମୁନାରୁ ସାଧାରଣ PCR ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ DNA ବାହାର କରାଯାଇଛି ଏବଂ ନମୁନା DNA ରେ XXX ଜିନ୍ ଅଛି |ନିଶ୍ଚିତକରଣ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ଆହୁରି କରାଯାଇପାରିବ |

ପଦାଙ୍କ 8

ଡିଜାଇନ୍ ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରାଥମିକତା |

ପରୀକ୍ଷଣ ପରେ ପରିବେଶ ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ପୋଛିଦେବା ପାଇଁ 2% ସୋଡିୟମ୍ ହାଇପୋକ୍ଲୋରାଇଟ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଏବଂ 70% ଇଥାନଲ୍ ସମାଧାନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ。