一 the ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ ：

1. ଉଚ୍ଚମାନର RNA ：

ସଫଳ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଉଚ୍ଚମାନର RNA ରୁ ଆସିଥାଏ |ଉଚ୍ଚ-ଗୁଣାତ୍ମକ RNA ଅନ୍ତତ full ପକ୍ଷେ ପୂର୍ଣ୍ଣ-ଲମ୍ବ ଏବଂ EDTA କିମ୍ବା SDS ପରି ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଇନହିବିଟରରୁ ମୁକ୍ତ ହେବା ଉଚିତ |RNA ର ଗୁଣବତ୍ତା ସର୍ବାଧିକ ପରିମାଣର କ୍ରମ ସୂଚନା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ ଯାହାକୁ ଆପଣ cDNA ରେ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ କରିପାରିବେ |ଏକ ସାଧାରଣ RNA ଶୁଦ୍ଧକରଣ ପଦ୍ଧତି ହେଉଛି ଗୁଆନାଡାଇନ୍ ଆଇସୋଥାଇଓସିୟାନେଟ୍ / ଏସିଡ୍ ଫେନୋଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଗୋଟିଏ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପଦ୍ଧତି |ବହୁ ପରିମାଣର RNase ଦ୍ am ାରା ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ, RNase ସମୃଦ୍ଧ ନମୁନାରୁ ପୃଥକ RNA (ଯେପରିକି ଅଗ୍ନାଶୟ) ଉଚ୍ଚମାନର RNA ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ ଫର୍ମାଲଡିହାଇଡରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ବିଶେଷତ long ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ |ମୂଷା ଯକୃତରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA ଏକ ସପ୍ତାହ ପାଇଁ ପାଣିରେ ଗଚ୍ଛିତ ହେବା ପରେ ଖରାପ ହୋଇଯାଇଥିଲାବେଳେ 3 ବର୍ଷ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପାଣିରେ ଗଚ୍ଛିତ ହେବା ପରେ ମୂଷା କଫରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA ସ୍ଥିର ରହିଲା |ଏଥିସହ, 4 kb ରୁ ଅଧିକ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଛୋଟ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟ ଅପେକ୍ଷା ଟ୍ରେନ୍ RNases ଦ୍ୱାରା ଅବକ୍ଷୟ ପାଇଁ ଅଧିକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ |ଗଚ୍ଛିତ RNA ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ସ୍ଥିରତା ବ To ାଇବାକୁ, RNA ଡିଓନାଇଜଡ୍ ଫର୍ମାମାଇଡରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୋଇ -70 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରେ |RNA ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଫର୍ମାମାଇଡ୍ ନିଶ୍ଚିତ ଭାବରେ RNA- କ୍ଷତିକାରକ ଆବର୍ଜନାରୁ ମୁକ୍ତ |ଅଗ୍ନାଶୟରୁ RNA ଅତି କମରେ ଏକ ବର୍ଷ ପାଇଁ ଫର୍ମାମାଇଡରେ ସଂରକ୍ଷିତ ହୋଇପାରିବ |RNA ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପ୍ରସ୍ତୁତ ହେବାବେଳେ, ଆପଣ RNA କୁ ପ୍ରବାହିତ କରିବା ପାଇଁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ପଦ୍ଧତିକୁ ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବେ: NaCl କୁ 0.2M ଏବଂ ଇଥାନଲ୍ର 4 ଗୁଣ ଯୋଗ କରନ୍ତୁ, ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 3-5 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ରଖନ୍ତୁ ଏବଂ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 10,000 × g ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ |

2. RNaseH- ନିଷ୍କ୍ରିୟ (RNaseH-) ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ：

ସିଡିଏନ୍ଏ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ର ଲମ୍ବ ଏବଂ ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଁ RNase ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥାଏ |ବଫର୍ ଏବଂ ହ୍ରାସକାରୀ ଏଜେଣ୍ଟ (ଯେପରିକି DTT) ଙ୍କ ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ RNase ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଯୋଡାଯିବା ଉଚିତ, କାରଣ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରକ୍ରିୟା ପ୍ରତିବନ୍ଧକକୁ ଦର୍ଶାଏ, ଯାହା ଦ୍ R ାରା RNA କୁ ଖରାପ କରିପାରେ |ପ୍ରୋଟିନ୍ RNase ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକ କେବଳ RNase A, B, C ଦ୍ R ାରା RNA ର ଅବକ୍ଷୟକୁ ରୋକିଥାଏ, ଏବଂ ଚର୍ମରେ RNase କୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରେ ନାହିଁ, ତେଣୁ ଏହି ଇନହିବିଟର ବ୍ୟବହାର ସତ୍ତ୍ RN େ ଆଙ୍ଗୁଳିରୁ RNase କୁ ପରିଚିତ କର ନାହିଁ |

ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ RNA କୁ cDNA ରେ ରୂପାନ୍ତର କରିଥାଏ |ଉଭୟ M-MLV ଏବଂ AMV ର ନିଜସ୍ୱ ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବ୍ୟତୀତ ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ RNaseH କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି |RNaseH କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏବଂ DNA ପ୍ରାଇମର୍ କିମ୍ବା ସିଡିଏନ୍ଏ ଏକ୍ସଟେନ୍ସନ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ଗଠିତ ହାଇବ୍ରିଡ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ ପାଇଁ ପରସ୍ପର ସହିତ ପ୍ରତିଦ୍ୱନ୍ଦ୍ୱିତା କରେ ଏବଂ RNA: DNA କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସରେ RNA ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡକୁ ଖରାପ କରେ |RNaseH କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦ୍ୱାରା ଖରାପ ହୋଇଥିବା RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଆଉ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବ ନାହିଁ, ଯାହା cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ର ଅମଳ ଏବଂ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ହ୍ରାସ କରେ |ତେଣୁ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ର RNaseH କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ହଟାଇବା କିମ୍ବା ବହୁ ମାତ୍ରାରେ ହ୍ରାସ କରିବା ଲାଭଦାୟକ ହେବ |

ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ Ⅱ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପେଟେଜ୍, RNaseH- MMLV ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଏବଂ ଥର୍ମୋସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍, RNaseH- AMV, MMLV ଏବଂ AMV ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ପରିମାଣ ଏବଂ ଅଧିକ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ c ର୍ଘ୍ୟ cDNA ହାସଲ କରିପାରିବ |CDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପରିମାଣ ଦ୍ୱାରା RT-PCR ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ପ୍ରଭାବିତ ହେବ |ଥର୍ମୋସ୍କ୍ରିପ୍ଟ AMV ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ |RT-PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ଆକାର cDNA କୁ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ କ୍ଷମତା ଦ୍ୱାରା ସୀମିତ, ବିଶେଷତ larger ବୃହତ cDNA ଗୁଡ଼ିକୁ କ୍ଲୋନିଂ କରିବା ସମୟରେ |MMLV ତୁଳନାରେ, ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ ଲମ୍ବା RT-PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ଅମଳକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି କଲା |RNaseH- ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ମଧ୍ୟ ଥର୍ମୋଷ୍ଟେବିଲିଟି ବୃଦ୍ଧି କରିଛି, ତେଣୁ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସାଧାରଣ 37-42 ° C ଠାରୁ ଅଧିକ ତାପମାତ୍ରାରେ କରାଯାଇପାରିବ |ପରାମର୍ଶିତ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଅବସ୍ଥାରେ, ଅଲିଗୋ (dT) ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ [α-P] dCTP ର 10 μCi ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡର ମୋଟ ଅମଳ TCA ବୃଷ୍ଟିପାତ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ପୂର୍ଣ୍ଣ-ଲମ୍ବ cDNA କୁ ସାଇଜ୍-ସର୍ଟ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ କ୍ଷାରୀୟ ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |

3. ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ବ ise ：

ଏକ ଉଚ୍ଚ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା RNA ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ଖୋଲିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିଥାଏ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି କରିଥାଏ |ଅଧିକାଂଶ RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପାଇଁ, ବଫର୍ କିମ୍ବା ଲୁଣ ବିନା RNA ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ 65 ° C ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରିବା ଦ୍ ice ାରା, ବରଫରେ ଶୀଘ୍ର ଥଣ୍ଡା ହେବା ଦ୍ secondary ାରା ଅଧିକାଂଶ ଦଳୀୟ ସଂରଚନା ଦୂର ହୋଇଯିବ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ବାନ୍ଧିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେବ |ତଥାପି, କିଛି ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡିକରେ ଉତ୍ତାପ ବିଭାଜନ ପରେ ମଧ୍ୟ ଦଳୀୟ ସଂରଚନା ଅଛି |ଥର୍ମୋସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରାରେ ସ୍ଥାନିତ କରି ଏହି କଠିନ ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡିକର ବିସ୍ତାର କରାଯାଇପାରିବ |ଉଚ୍ଚ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ମଧ୍ୟ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବ can ାଇପାରେ, ବିଶେଷତ when ଯେତେବେଳେ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ (GSP) ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ (ଅଧ୍ୟାୟ 3 ଦେଖନ୍ତୁ) |ଯଦି ଜିଏସପି ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି, ନିଶ୍ଚିତ କରନ୍ତୁ ଯେ ପ୍ରିମିୟରର Tm ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ସହିତ ସମାନ |60 ° C ରୁ ଅଧିକ ଅଲିଗୋ (dT) ଏବଂ ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ନାହିଁ |ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ 60 ° C କୁ ବୃଦ୍ଧି ହେବା ପୂର୍ବରୁ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 25 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଏକ ଉଚ୍ଚ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ତାପମାତ୍ରା ବ୍ୟବହାର କରିବା ସହିତ, RNA / ପ୍ରାଇମର୍ ମିଶ୍ରଣକୁ 65 ° C denaturation ତାପମାତ୍ରାରୁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରାକୁ ସିଧାସଳଖ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରି ଏବଂ ପୂର୍ବ-ଉତ୍ତାପିତ 2 × ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣ (cDNA ହଟ-ଷ୍ଟାର୍ଟ ସିନ୍ଥେସିସ୍) ଯୋଗ କରି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ମଧ୍ୟ ଉନ୍ନତ ହୋଇପାରିବ |ଏହି ପଦ୍ଧତି କମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ଘଟୁଥିବା ଇଣ୍ଟରମୋଲୋକୁଲାର ବେସ୍ ଯୋଡିକୁ ରୋକିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |RT-PCR ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ହେଉଥିବା ଏକାଧିକ ତାପମାତ୍ରା ସୁଇଚ୍ ଏକ ଥର୍ମାଲ୍ ସାଇକ୍ଲର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସରଳ ହୋଇପାରିବ |

Tth ଥର୍ମୋଷ୍ଟେବଲ୍ ପଲିମେରେଜ୍ Mg2 + ର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଏବଂ DNA Mn2 + ଉପସ୍ଥିତିରେ RNA ପଲିମେରେଜ୍ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ |ଏହାକୁ ସର୍ବାଧିକ 65 ° C ତାପମାତ୍ରାରେ ଗରମ ରଖାଯାଇପାରିବ |ତଥାପି, PCR ସମୟରେ Mn2 + ର ଉପସ୍ଥିତି ବିଶ୍ୱସନୀୟତାକୁ ହ୍ରାସ କରେ, ଯାହା ସିଡିଏନ୍ଏର କ୍ଲୋନିଂ ପରି ଉଚ୍ଚ ସଠିକତା ବୃଦ୍ଧି ପାଇଁ Tth ପଲିମେରେଜ୍କୁ କମ୍ ଉପଯୁକ୍ତ କରିଥାଏ |ଏହା ସହିତ, Tth ରେ କମ୍ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଦକ୍ଷତା ଅଛି, ଯାହା ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ହ୍ରାସ କରିଥାଏ, ଏବଂ, ଯେହେତୁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଏବଂ PCR ଗୋଟିଏ ଏନଜାଇମ୍ ସହିତ କରାଯାଇପାରିବ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ବିନା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ସିଡିଏନ୍ଏ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଉତ୍ପାଦକୁ ଦୂଷିତ ଜେନୋମିକ୍ DNA ସହିତ ତୁଳନା କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ |ବିସ୍ତାରଣ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ଅଲଗା କରାଯାଇଥିଲା |

4. ଯୋଗୀ ଯାହା ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ ：

ଗ୍ଲାଇସେରୋଲ ଏବଂ DMSO ସହିତ ଯୋଗଗୁଡିକ ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥାଏ, ଯାହା ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡର ସ୍ଥିରତାକୁ ହ୍ରାସ କରିପାରେ ଏବଂ RNA ର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନକୁ ଖୋଲିପାରେ |ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II କିମ୍ବା MMLV କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରଭାବିତ ନକରି 20% ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଗ୍ଲାଇସେରଲ୍ କିମ୍ବା 10% DMSO ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନଷ୍ଟ ନକରି AMV 20% ଗ୍ଲାଇସେରୋଲକୁ ମଧ୍ୟ ସହ୍ୟ କରିପାରିବ |SuperScriptⅡ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ RT-PCR ର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ବ imize ାଇବାକୁ, 10% ଗ୍ଲାଇସେରୋଲ୍ 45 ° C ରେ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |ଯଦି ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦର 1/10 PCR ରେ ଯୋଡା ଯାଇଥାଏ, ତେବେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଗ୍ଲାଇସେରୋଲର ଏକାଗ୍ରତା 0.4% ଅଟେ, ଯାହା PCR କୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିବା ପାଇଁ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ନୁହେଁ |

5. RNaseH ଚିକିତ୍ସା ：

PCR ପୂର୍ବରୁ RNaseH ସହିତ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ଚିକିତ୍ସା ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବ can ାଇପାରେ |କିଛି ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପାଇଁ, ଏହା ଚିନ୍ତା କରାଯାଏ ଯେ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ RNA ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦ୍ରବ୍ୟର ବନ୍ଧନକୁ ରୋକିଥାଏ, ଯେଉଁ କ୍ଷେତ୍ରରେ RNaseH ଚିକିତ୍ସା ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବ increase ାଇପାରେ |ସାଧାରଣତ ,, ଲମ୍ବା ପୂର୍ଣ୍ଣ-ଲମ୍ବ cDNA ଟାର୍ଗେଟ୍ ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡିକ ବୃଦ୍ଧି କରିବାବେଳେ RNaseH ଚିକିତ୍ସା ଆବଶ୍ୟକ, ଯେପରିକି ଲୋ-କପି ଟ୍ୟୁବର୍ସ ସ୍କେରୋସିସ୍ II |ଏହି କଠିନ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପାଇଁ, RNaseH ଚିକିତ୍ସା ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II କିମ୍ବା AMV- ସିନ୍ଥେସାଇଜଡ୍ cDNA ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ସଙ୍କେତକୁ ବ anced ାଇଲା |ଅଧିକାଂଶ RT-PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ, RNaseH ଚିକିତ୍ସା ବ al କଳ୍ପିକ, କାରଣ 95 ° C ରେ PCR denaturation ପଦକ୍ଷେପ ସାଧାରଣତ the RNA ରେ RNA ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ କରେ: DNA କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ |

6. ଛୋଟ RNA ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତିର ଉନ୍ନତି ：

ଯେତେବେଳେ ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର RNA ଉପଲବ୍ଧ ହୁଏ, ସେତେବେଳେ RT-PCR ବିଶେଷ ଆହ୍ .ାନ ଅଟେ |ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ସମୟରେ ବାହକ ଭାବରେ ଯୋଡି ହୋଇ ଛୋଟ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |ଟ୍ରାଇଜୋଲ୍ ଯୋଡିବା ସହିତ RNase ମୁକ୍ତ ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ ଏକ ସମୟରେ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ ଜଳରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ଅଟେ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବୃଷ୍ଟିପାତକୁ ସାହାଯ୍ୟ କରିବା ପାଇଁ RNA ସହିତ ଜଳୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ରଖାଯାଇପାରିବ |50 ମିଗ୍ରା ରୁ କମ୍ ଟିସୁ କିମ୍ବା 106 ସଂସ୍କୃତ କୋଷ ପାଇଁ ନମୁନା ପାଇଁ, RNase ମୁକ୍ତ ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ୍ର ପରାମର୍ଶିତ ଏକାଗ୍ରତା ହେଉଛି 250 μg / ml |

ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II ବ୍ୟବହାର କରି ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଆସେଟିଲେଟେଡ୍ ବିଏସ୍ଏ ଯୋଗ କଲେ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବ increase ିପାରେ ଏବଂ ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର RNA ପାଇଁ ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II ର ପରିମାଣ ହ୍ରାସ ହୁଏ ଏବଂ 40 ୟୁନିଟ୍ RNaseOut ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ଇନହିବିଟର ଯୋଗ କଲେ ଚିହ୍ନଟ ସ୍ତର ବ can ିପାରେ |ଯଦି RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ତେବେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II ବ୍ୟବହାର କରିବାବେଳେ BSA କିମ୍ବା RNase ଇନହିବିଟର ଯୋଡିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |

RT RT RT-PCR ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ |

1. CND ଅସୀଥେସିସ୍ ：

ତିନୋଟି ଭିନ୍ନ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିଡିଏନ୍ଏ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭ କରାଯାଇପାରେ, ଯାହାର ଆପେକ୍ଷିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସିଡିଏନ୍ଏସ୍ ର ପରିମାଣ ଏବଂ ପ୍ରକାରକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିଥାଏ |

ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ପଦ୍ଧତି ତିନୋଟି ପଦ୍ଧତିର ସର୍ବନିମ୍ନ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଥିଲା |ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟରେ ଏକାଧିକ ସାଇଟରେ ପ୍ରାଇମର୍ ଆନ୍ନାଲ୍, କ୍ଷୁଦ୍ର, ଆଂଶିକ-ଲମ୍ବ cDNA ସୃଷ୍ଟି କରେ |ଏହି ପଦ୍ଧତି ବାରମ୍ବାର 5 ′ ଶେଷ କ୍ରମ ପାଇବା ପାଇଁ ଏବଂ RNA ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡିକରୁ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନାର ଅଞ୍ଚଳ କିମ୍ବା ସମାପ୍ତି ସାଇଟଗୁଡିକ ସହିତ cDNA ପାଇବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ ଯାହା ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଦ୍ୱାରା ନକଲ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |ଦୀର୍ଘତମ cDNA ପାଇବା ପାଇଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ RNA ନମୁନାରେ ପ୍ରାଥମିକତା RNA ସହିତ ଅନୁପାତ ସାମୟିକ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ |ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମରଗୁଡିକର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏକାଗ୍ରତା 20 μl ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 50 ରୁ 250 ng ମଧ୍ୟରେ ଥିଲା |ଯେହେତୁ ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସମୁଦାୟ RNA ରୁ ସିଡିଏନ୍ଏସ୍ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଛି ମୁଖ୍ୟତ rib ରାଇବୋସୋମାଲ୍ RNA, ପଲି (A) + RNA ସାଧାରଣତ the ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ଚୟନ କରାଯାଏ |

ଅଲିଗୋ (dT) ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଅନିୟମିତ ପ୍ରାଇମର୍ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ |ଏହା ଅଧିକାଂଶ ଇଉକାରିଓଟିକ୍ mRNA ର ′ ′ ଶେଷରେ ମିଳୁଥିବା ପଲି (A) ଲାଞ୍ଜକୁ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜ୍ କରେ |କାରଣ ପଲି (A) + RNA ସମୁଦାୟ RNA ର ପ୍ରାୟ 1% ରୁ 2% ଅଟେ, cDNA ର ପରିମାଣ ଏବଂ ଜଟିଳତା ଅନିୟମିତ ପ୍ରାଇମର୍ ତୁଳନାରେ ବହୁତ କମ୍ ଅଟେ |ଏହାର ଉଚ୍ଚ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ହେତୁ, ଅଲିଗୋ (dT) ସାଧାରଣତ prim ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ପଲି (A) + ଚୟନ ସହିତ RNA ଅନୁପାତର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ନାହିଁ |20μl ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀରେ 0.5μg ଅଲିଗୋ (dT) ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |oligo (dT) 12-18 ଅଧିକାଂଶ RT-PCR ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |ଥର୍ମୋସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ଆରଟି- PCR ସିଷ୍ଟମ ଅଧିକ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ପାଇଁ ଉତ୍ତମ ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ହେତୁ ଅଲିଗୋ (dT) 20 ପ୍ରଦାନ କରେ |

ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ (GSP) ହେଉଛି ସବୁଠାରୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ |ଜିଏସପି ହେଉଛି ଏକ ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏଟାଇଡ୍ ଯାହା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ RNA ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମରେ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜ୍ ହୋଇପାରେ, ଅନିୟମିତ ପ୍ରାଇମର୍ କିମ୍ବା ଅଲିଗୋ (dT) ପରି, ଯାହା ସମସ୍ତ RNA ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ |PCR ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ସମାନ ନିୟମ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ GSP ର ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ |ଜିଏସପି ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ ସମାନ କ୍ରମ ହୋଇପାରେ ଯାହା mRNA ର 3′-ଅଧିକାଂଶ ଶେଷରେ ଆନ୍ନାଲ୍ ହୁଏ, କିମ୍ବା GSP ଓଲଟା ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପ୍ରାଇମରର ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇପାରେ |କେତେକ ବର୍ଦ୍ଧିତ ବିଷୟ ପାଇଁ, ଏକରୁ ଅଧିକ ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ ପ୍ରାଇମର୍ ସଫଳ RT-PCR ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ କାରଣ ଲକ୍ଷ୍ୟ RNA ର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ପ୍ରାଥମିକ ବନ୍ଧନକୁ ରୋକିପାରେ |20 pml ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 1 pmol ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ GSP ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |

2. ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ବ ise ：

ଜିଏସପି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସୁବିଧାଗୁଡ଼ିକର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଲାଭ ଉଠାଇବାକୁ, ଉଚ୍ଚ ଥର୍ମୋଷ୍ଟାବିଲିଟି ସହିତ ଏକ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯିବା ଉଚିତ |ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳତା ବ to ାଇବା ପାଇଁ ଥର୍ମୋଷ୍ଟେବଲ୍ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେସ୍ ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇପାରେ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଯଦି 55 ° C ରେ ଏକ GSP ଆନ୍ନାଲ୍ ହୁଏ, ତେବେ 37 ° C ର କମ୍ ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗେନ୍ସିରେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ AMV କିମ୍ବା M-MLV ବ୍ୟବହୃତ ହେଲେ GSP ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେବ ନାହିଁ |ଅବଶ୍ୟ, ସୁପରସ୍କ୍ରିପ୍ଟ II ଏବଂ ଥର୍ମୋସ୍କ୍ରିପ୍ଟକୁ 50 ° C କିମ୍ବା ତଦୁର୍ଦ୍ଧ୍ୱରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରାଯାଇପାରେ, ଯାହା ନିମ୍ନ ତାପମାତ୍ରାରେ ଉତ୍ପନ୍ନ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉତ୍ପାଦକୁ ଦୂର କରିବ |ସର୍ବାଧିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପାଇଁ, RNA / ପ୍ରାଇମର୍ ମିଶ୍ରଣକୁ 65 ° C ଡେନାଟ୍ରେସନ୍ ତାପମାତ୍ରା ଠାରୁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରାକୁ ସିଧାସଳଖ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ ପୂର୍ବ-ଉତ୍ତାପିତ 2 × ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣରେ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ (cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ହଟ୍ ଷ୍ଟାର୍ଟ) |ଏହା କମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ଇଣ୍ଟରମୋଲୋକୁଲାର ବେସ୍ ଯୋଡିକୁ ରୋକିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |RT-PCR ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ହେଉଥିବା ଏକାଧିକ ତାପମାତ୍ରା ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଏକ ଥର୍ମାଲ୍ ସାଇକ୍ଲର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସରଳ ହୋଇପାରିବ |

3. ଜେନୋମିକ୍ DNA ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ହ୍ରାସ କରେ ：

RT-PCR ସହିତ ସମ୍ମୁଖୀନ ହୋଇଥିବା ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଅସୁବିଧା ହେଉଛି RNA ରେ ଜେନୋମିକ୍ DNA ର ଦୂଷିତ |ଏକ ଭଲ RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିବା, ଯେପରିକି ଟ୍ରାଇଜୋଲ୍ ରେଜେଣ୍ଟ୍, RNA ପ୍ରସ୍ତୁତିକୁ ଦୂଷିତ କରୁଥିବା ଜେନୋମିକ୍ DNA ର ପରିମାଣକୁ ହ୍ରାସ କରିବ |ଜେନୋମିକ୍ DNA ରୁ ଉତ୍ପାଦିତ ଉତ୍ପାଦକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରଦୂଷିତ DNA ଅପସାରଣ କରିବାକୁ RNA କୁ ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍-ଗ୍ରେଡ୍ DNase I ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇପାରିବ |DNase I ହଜମ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ° ୦ ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 2.0 ମିଟର EDTA ରେ ନମୁନା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି ସମାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରାରେ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ-ନିର୍ଭରଶୀଳ RNA ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ରୋକିବା ପାଇଁ EDTA ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନକୁ ଚେଲେଟ୍ କରିପାରିବ |

ପ୍ରଦୂଷିତ ଜେନୋମିକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଉତ୍ପାଦରୁ ବର୍ଦ୍ଧିତ ସିଡିଏନ୍ଏକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ, ପ୍ରାଇମର୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇପାରିବ ଯାହା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆନ୍ନାଲ୍ ଅଲଗା କରିବା ପାଇଁ |CDNA ରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ଦୂଷିତ ଜେନୋମିକ୍ DNA ରୁ ଉତ୍ପାଦିତ ତୁଳନାରେ ଛୋଟ ହେବ |ଏହା ସହିତ, ପ୍ରତ୍ୟେକ RNA ଟେମ୍ପଲେଟରେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ବିନା ଏକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଖଣ୍ଡଟି ଜେନୋମିକ୍ DNA କିମ୍ବା cDNA ରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ ତାହା ସ୍ଥିର କରିବାକୁ |ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ବିନା ପ୍ରାପ୍ତ PCR ଉତ୍ପାଦ ଜିନୋମରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ |