1. ମ Basic ଳିକ ଜ୍ଞାନ (ଯଦି ଆପଣ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅଂଶ ଦେଖିବାକୁ ଚାହାଁନ୍ତି, ଦୟାକରି ଦ୍ୱିତୀୟ ଭାଗକୁ ସିଧାସଳଖ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ)

ପାରମ୍ପାରିକ PCR ର ଏକ ଡେରିଭେଟିଭ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଭାବରେ, ରିଅଲ୍ ଟାଇମ୍ PCR ମୁଖ୍ୟତ the ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସିଗ୍ନାଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରକୃତ ସମୟରେ PCR ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚକ୍ରରେ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ଉପରେ ନଜର ରଖେ ଏବଂ ସିଟି ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ମାନକ ବକ୍ର ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଟେମ୍ପଲେଟକୁ ପରିମାଣିକ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରେ |

RT-PCR ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ତଥ୍ୟ ହେଉଛି |ବେସ୍ ଲାଇନ୍ |, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୀମାଏବଂCt ମୂଲ୍ୟ

RT-PCR ପାଇଁ ସାଧାରଣ ଲେବଲ୍ ପଦ୍ଧତି:

2. ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପଦକ୍ଷେପ |

2.1 ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀ ବିଷୟରେ |- ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଏକାଧିକ କୂଅ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ଜ bi ବିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ହେବା ଜରୁରୀ |

2.2 ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ର ନୀତିଗୁଡିକ |

SiRNA ପ୍ରଜାତି-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ, ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରଜାତିର କ୍ରମ ଭିନ୍ନ ହେବ |

SiRNA ଫ୍ରିଜ୍-ଶୁଖାଯାଇଥିବା ପାଉଡରରେ ପ୍ୟାକେଜ୍ ହୋଇଛି, ଯାହା ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 2-4 ସପ୍ତାହ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରିବ |

3.3 ସାଧନ କିମ୍ବା ପୁନ ag ଯାହାକି ଆଗରୁ ପ୍ରସ୍ତୁତ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ |

2.4 ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକରେ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଆବଶ୍ୟକ କରୁଥିବା ବିଷୟଗୁଡ଼ିକ ବିଷୟରେ:

①siRNA ସଂକ୍ରମଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା |

1. ପ ingingে ଟିଂ ପାଇଁ, ଆପଣ 24-କୂଅ ପ୍ଲେଟ୍, 12-କୂଅ ପ୍ଲେଟ୍ କିମ୍ବା 6-କୂଅ ପ୍ଲେଟ୍ (24-କୂଅ ପ୍ଲେଟର ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂଅରେ ପ୍ରସ୍ତାବିତ ହାରାହାରି RNA ଏକାଗ୍ରତା ପ୍ରାୟ 100-300 ng / uL) ବାଛିପାରିବେ, ଏବଂ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସର୍ବୋଚ୍ଚ ସଂକ୍ରମଣ ଘନତା 60% -80% କିମ୍ବା ଅଧିକ |

2. ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆବଶ୍ୟକତା ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁଯାୟୀ କଠୋର ଅଟେ |

3. ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ପରେ, mRNA ଚିହ୍ନଟ (RT-PCR) କିମ୍ବା 48-96 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ 24-72 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇପାରିବ |

② RNA ନିଷ୍କାସନ ପ୍ରକ୍ରିୟା |

1. ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ଏନଜାଇମ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ରୋକନ୍ତୁ |ଏଥିରେ ମୁଖ୍ୟତ mas ମାସ୍କ ଏବଂ ଗ୍ଲୋଭସ୍ ପିନ୍ଧିବା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ;ନିର୍ଜଳ ପାଇପେଟ୍ ଟିପ୍ସ ଏବଂ ଇପି ଟ୍ୟୁବ୍ ବ୍ୟବହାର କରି;ପରୀକ୍ଷଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ଜଳ ନିଶ୍ଚିତ ଭାବରେ RNase ମୁକ୍ତ ଅଟେ |

2. ଶୀଘ୍ର ନିଷ୍କାସନ କିଟ୍ ରେ ପରାମର୍ଶ ଅନୁଯାୟୀ ଦୁଇଥର କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି, ଯାହା ପ୍ରକୃତରେ ଶୁଦ୍ଧତା ଏବଂ ଅମଳରେ ଉନ୍ନତି ଆଣିବ |

3. ବର୍ଜ୍ୟ ତରଳ RNA ସ୍ତମ୍ଭକୁ ସ୍ପର୍ଶ କରିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |

③ RNA ପରିମାଣ

RNA ବାହାର କରାଯିବା ପରେ, ଏହାକୁ ସିଧାସଳଖ ନାନୋଡ୍ରପ୍ ସହିତ ପରିମାଣ କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ ସର୍ବନିମ୍ନ ପଠନ 10ng / ul ପରି କମ୍ ହୋଇପାରେ |

ଓଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା |

1. RT-qPCR ର ଉଚ୍ଚ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ହେତୁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ଅତି କମରେ 3 ଟି ସମାନ୍ତରାଳ କୂଅ ତିଆରି କରାଯିବା ଉଚିତ ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ Ct କୁ ଭିନ୍ନ ନହେବା କିମ୍ବା ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ SD ବହୁତ ବଡ ନହେବା ପାଇଁ |

2. ମାଷ୍ଟର ମିଶ୍ରଣକୁ ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍ କରନ୍ତୁ ନାହିଁ |

3. ପ୍ରତ୍ୟେକ ଟ୍ୟୁବ୍ / ଗର୍ତ୍ତକୁ ଏକ ନୂତନ ଟିପ୍ ସହିତ ବଦଳାଇବା ଜରୁରୀ!ନମୁନା ଯୋଡିବା ପାଇଁ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ସମାନ ପାଇପେଟ୍ ଟିପ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ନାହିଁ!

4. ନମୁନା ଯୋଡିବା ପରେ 96-କୂଅ ପ୍ଲେଟରେ ଲାଗିଥିବା ଚଳଚ୍ଚିତ୍ରକୁ ଏକ ପ୍ଲେଟ ସହିତ ସଫାସୁତୁରା କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |ଏହାକୁ ମେସିନରେ ରଖିବା ପୂର୍ବରୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରିବା ଭଲ, ଯାହାଫଳରେ ଟ୍ୟୁବ୍ କାନ୍ଥରେ ଥିବା ତରଳ ପଦାର୍ଥ ପ୍ରବାହିତ ହୋଇ ବାୟୁ ବବୁଲଗୁଡିକ ବାହାର କରିପାରେ |

Om ସାଧାରଣ ବକ୍ର ବିଶ୍ଳେଷଣ |

2.5 ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣ ବିଷୟରେ |

QPCR ର ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣ ଏବଂ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିମାଣରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇପାରେ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀର କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା ଗୋଷ୍ଠୀର କୋଷଗୁଡ଼ିକ,

X ଜିନ୍ ର mRNA କେତେ ଥର ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୁଏ, ଏହା ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣ ଅଟେ;ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟକ କୋଷରେ, X ଜିନ୍ ର mRNA |

କେତେ କପି ଅଛି, ଏହା ହେଉଛି ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିମାଣ |ସାଧାରଣତ what ଆମେ ଲାବୋରେଟୋରୀରେ ଅଧିକ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ହେଉଛି ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତି |ସାଧାରଣତ ,,2-ΔΔct ପଦ୍ଧତି |ପରୀକ୍ଷଣରେ ସର୍ବାଧିକ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ତେଣୁ କେବଳ ଏହି ପଦ୍ଧତି ଏଠାରେ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ପରିଚିତ ହେବ |

2-ΔΔct ପଦ୍ଧତି: ପ୍ରାପ୍ତ ଫଳାଫଳ ହେଉଛି କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଗ୍ରୁପରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ସହିତ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିର ପାର୍ଥକ୍ୟ |ଏହା ଆବଶ୍ୟକ ଯେ ଉଭୟ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଜିନ୍ ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା 100% ପାଖାପାଖି, ଏବଂ ଆପେକ୍ଷିକ ବିଚ୍ୟୁତି 5% ରୁ ଅଧିକ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |

ଗଣନା ପଦ୍ଧତି ନିମ୍ନଲିଖିତ ଅଟେ:

Controlct କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଗ୍ରୁପ୍ = କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ର ct ମୂଲ୍ୟ - କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ରେ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଜିନ୍ ର ct ମୂଲ୍ୟ |

Δct ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀ = ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଜିନ୍ ର ct ମୂଲ୍ୟ - ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀର ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଜିନ୍ ର ct ମୂଲ୍ୟ |

ΔΔct = Δct ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀ- Δct ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀ |

ଶେଷରେ, ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସ୍ତରରେ ପାର୍ଥକ୍ୟର ଏକାଧିକ ଗଣନା କରନ୍ତୁ:

ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରନ୍ତୁ = 2-ΔΔct (ଏକ୍ସେଲ୍ ଫଙ୍କସନ୍ ସହିତ POWER)

ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ:

ସେଲ୍ ସିଧାସଳଖ RT-qPCR କିଟ୍ |