ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ଆଧାର (99% ସମସ୍ୟାର ସମାଧାନ ହୋଇପାରିବ)
1. ପ୍ରାଥମିକ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ: ପାଠ୍ୟ ପୁସ୍ତକ 15-30bp ଆବଶ୍ୟକ କରେ, ସାଧାରଣତ about ପ୍ରାୟ 20bp |ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରକୃତ ଅବସ୍ଥା 18-24bp ହେବା ଭଲ, କିନ୍ତୁ ଯେତେ ଅଧିକ ଭଲ, ଅଧିକ ଲମ୍ବା ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ହ୍ରାସ କରିବ ଏବଂ ଅମଳ ହ୍ରାସ କରିବ |
2. ପ୍ରାଇମର୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ସ୍ପାନ୍: 200-500bp ଉପଯୁକ୍ତ, ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅବସ୍ଥାରେ ଖଣ୍ଡକୁ 10kb କୁ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇପାରିବ |
3. ପ୍ରାଥମିକ ଆଧାର: G + C ର ବିଷୟବସ୍ତୁ 40-60% ହେବା ଉଚିତ, ବହୁତ କମ୍ G + C ବିସ୍ତାର ପ୍ରଭାବ ଭଲ ନୁହେଁ, ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯିବା ପାଇଁ G + C ସହଜ ଅଟେ |5 ରୁ ଅଧିକ ପ୍ୟୁରିନ୍ କିମ୍ବା ପିରାଇମିଡାଇନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ସର କ୍ଲଷ୍ଟରକୁ ଏଡାଇ, ଏଟିଜିସି ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ବିତରଣ ହୁଏ |ସ୍ଥିରତା ବ to ାଇବା ପାଇଁ ′ ′ ଶେଷ ଏବଂ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ କ୍ରମ ପାଇଁ ମଲ୍ଟି- gc, ′ ′ ଶେଷରେ ଧନୀ ଜିସିରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ, ଶେଷ bas ଟି ଆଧାର ପାଇଁ କ G ଣସି ଜିସି ନାହିଁ, କିମ୍ବା ଶେଷ bas ଟି ବେସ୍ ମଧ୍ୟରୁ GC ପାଇଁ GC ନାହିଁ |
4. ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକରେ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ, ଏବଂ ଦୁଇଟି ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ସଂପନ୍ନତାକୁ ଏଡାନ୍ତୁ, ବିଶେଷତ 3 3 'ଶେଷରେ ସଂପନ୍ନତା, ନଚେତ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଗଠନ ହେବ ଏବଂ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧିତ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ସୃଷ୍ଟି ହେବ |
5. ପ୍ରାଇମରଗୁଡିକର 3 'ଶେଷରେ ଥିବା ବେସ୍, ବିଶେଷତ the ଶେଷ ଏବଂ ଶେଷ ବେସ୍, ଅବିଭକ୍ତ ଟର୍ମିନାଲ୍ ବେସ୍ କାରଣରୁ PCR ବିଫଳତାକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ କଠୋର ଭାବରେ ଯୋଡି ହେବା ଉଚିତ |
6. ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଉପଯୁକ୍ତ କ୍ଲାଭେଜ୍ ସାଇଟ୍ ସହିତ ଯୋଡି ହୋଇପାରେ କିମ୍ବା ଯୋଡିହେବ, ଏବଂ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମରେ ଉପଯୁକ୍ତ ଭାବରେ ଉପଯୁକ୍ତ କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟ୍ ରହିବା ଉଚିତ, ଯାହା କ୍ଲାଭେଜ୍ ଆନାଲିସିସ୍ କିମ୍ବା ମଲିକୁଲାର କ୍ଲୋନିଂ ପାଇଁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଲାଭଦାୟକ |
7. ପ୍ରାଥମିକତାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା: ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ କ୍ରମ ଡାଟାବେସରେ ଅନ୍ୟ କ୍ରମ ସହିତ ପ୍ରାଥମିକମାନଙ୍କର କ obvious ଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋମୋଲୋଜି ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |
8. ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ଶିଖନ୍ତୁ: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ଏହି ଅନଲାଇନ୍ ଡିଜାଇନ୍ ସର୍ବୋତ୍ତମ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ) |
ଉପରୋକ୍ତ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଅତିକମରେ 99% ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ସମସ୍ୟାର ସମାଧାନ କରିପାରିବ |
ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନର ବିବରଣୀକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |
1. ପ୍ରାଥମିକ ଲମ୍ବ |
ସାଧାରଣ ପ୍ରାଥମିକ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ହେଉଛି 18 ~ 30 ଆଧାର |ସାଧାରଣତ ,, ପ୍ରାଇମରର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରୁଥିବା ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କାରଣ ହେଉଛି ପ୍ରାଇମରର ଲମ୍ବ |ପ୍ରାଥମିକର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ସାଧାରଣତ selected ମନୋନୀତ ହୋଇଛି (Tm ମୂଲ୍ୟ -5 ℃), ଏବଂ କେତେକ ସିଧାସଳଖ Tm ମୂଲ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତି |ପ୍ରାଥମିକ ସୂତ୍ରଗୁଡ଼ିକର ତାପମାତ୍ରା ହିସାବ କରିବାକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ସୂତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |
ଯେତେବେଳେ ପ୍ରାଇମରର ଲମ୍ବ 20bp ରୁ କମ୍: [4 (G + C) +2 (A + T)] - 5 ℃
ଯେତେବେଳେ ପ୍ରାଇମରର ଲମ୍ବ 20bp ରୁ ଅଧିକ: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / ଲମ୍ବ -5 ℃
ଏଥିସହ, ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରାକୁ ଗଣିବା ପାଇଁ ଅନେକ ସଫ୍ଟୱେର୍ ମଧ୍ୟ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ, ଗଣନା ନୀତି ଭିନ୍ନ ହେବ, ତେଣୁ ବେଳେବେଳେ ଗଣିତ ମୂଲ୍ୟରେ ଏକ ଛୋଟ ବ୍ୟବଧାନ ରହିପାରେ |PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ, କ୍ଷୁଦ୍ରତମ ପ୍ରାଥମିକତା ଯାହା 54 less ରୁ କମ୍ ତାପମାତ୍ରାକୁ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରେ ସର୍ବୋତ୍ତମ ଦକ୍ଷତା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |
ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅତିରିକ୍ତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଥମିକତା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଚାରି ଗୁଣ ବ increases ିଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ most ାରା ଅଧିକାଂଶ ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ସର୍ବନିମ୍ନ ପ୍ରାଥମିକ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ହେଉଛି 18 ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ |ପ୍ରାଥମିକ ଦ length ର୍ଘ୍ୟର ଉପର ସୀମା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ, ମୁଖ୍ୟତ reaction ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଦକ୍ଷତା ସହିତ ଜଡିତ |ଏଣ୍ଟ୍ରପି କାରଣରୁ, ପ୍ରାଇମର୍ ଯେତେ ଅଧିକ ହେବ, ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ ଏକ ସ୍ଥିର ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ଏହା ଧାର୍ଯ୍ୟ DNA ସହିତ ବାନ୍ଧିବା ହାରରେ କମ୍ ହେବ |
ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ପାଇଁ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାବେଳେ, ପ୍ରାଇମରଗୁଡିକର ଲମ୍ବ ପ୍ରତିବଦଳରେ ଟିଏମ ମୂଲ୍ୟ ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇପାରେ, ବିଶେଷତ flu ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣିକ PCR, TM = 60 prim କିମ୍ବା ଏହାକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯିବା ଉଚିତ |
2.GC ବିଷୟବସ୍ତୁ
ସାଧାରଣତ ,, ପ୍ରାଥମିକ କ୍ରମରେ G + C ର ବିଷୟବସ୍ତୁ 40% ~ 60% ଅଟେ, ଏବଂ ଜିସି ବିଷୟବସ୍ତୁ ଏବଂ ଏକ ଯୁଗଳ ପ୍ରାଇମରର Tm ମୂଲ୍ୟ ସମନ୍ୱିତ ହେବା ଉଚିତ |ଯଦି ପ୍ରାଇମେରର ଏକ ଗମ୍ଭୀର GC କିମ୍ବା AT ପ୍ରବୃତ୍ତି ଥାଏ, ତେବେ ପ୍ରାଇମର 5 'ଶେଷରେ ଉପଯୁକ୍ତ ପରିମାଣର A, T କିମ୍ବା G ଏବଂ C ଲାଞ୍ଜ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |
3. ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା |
ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ଅପରିଷ୍କୃତ ତାପମାତ୍ରା ଠାରୁ 5 ℃ କମ୍ ହେବା ଉଚିତ୍ |ଯଦି ପ୍ରାଇମର୍ ବେସ୍ ସଂଖ୍ୟା କମ୍, ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ଉପଯୁକ୍ତ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇପାରେ, ଯାହା PCR ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବ increase ାଇପାରେ |ଯଦି ବେସ୍ ସଂଖ୍ୟା ଅଧିକ, ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ଉପଯୁକ୍ତ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରାଯାଇପାରେ |4 ℃ ~ 6 prim ର ଏକ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ପାର୍ଥକ୍ୟ PCR ଅମଳ ଉପରେ କ not ଣସି ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ ଆଦର୍ଶରେ ଏକ ଯୁଗଳ ପ୍ରାଇମରର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ସମାନ, ଯାହା 55 ℃ ~ 75 between ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |
4. ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଟେମ୍ପଲେଟର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା କ୍ଷେତ୍ରରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |
ବର୍ଦ୍ଧିତ ଖଣ୍ଡ ବାଛିବାବେଳେ ଟେମ୍ପଲେଟର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ଅଞ୍ଚଳକୁ ଏଡାଇବା ଭଲ |ଟାର୍ଗେଟ୍ ଖଣ୍ଡର ସ୍ଥିର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନାକୁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ କମ୍ପ୍ୟୁଟର ସଫ୍ଟୱେର୍ ଦ୍ୱାରା ପୂର୍ବାନୁମାନ କରାଯାଇପାରେ ଏବଂ ଆକଳନ କରାଯାଇପାରେ, ଯାହା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଚୟନ ପାଇଁ ସହାୟକ ହୋଇଥାଏ |ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ସମ୍ପ୍ରସାରଣ ହେବାକୁ ଥିବା ଅଞ୍ଚଳର ମାଗଣା ଶକ୍ତି (△ G) 58.6lkJ / mol ରୁ କମ୍ ହେଲେ ବିସ୍ତାର ପ୍ରାୟତ un ଅସଫଳ ହୋଇଥାଏ |
5. ଲକ୍ଷ୍ୟ DNA ସହିତ ମେଳ ଖାଉ ନାହିଁ |
ଯେତେବେଳେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଟାର୍ଗେଟ୍ DNA କ୍ରମ ବଡ଼, ଏକ ପ୍ରାଇମର୍ ଟାର୍ଗେଟ୍ DNA ର ଏକାଧିକ ଅଂଶ ସହିତ ବାନ୍ଧି ହୋଇପାରେ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଫଳାଫଳରେ ଏକାଧିକ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯାଏ |ଏଥର ବ୍ଲାଷ୍ଟ ସଫ୍ଟୱେର୍ ପରୀକ୍ଷା, ୱେବସାଇଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଆବଶ୍ୟକ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/।ଦୁଇଟି କ୍ରମକୁ ଆଲାଇନ୍ କରନ୍ତୁ (bl2seq) |
ଜୋନ୍ 1 ରେ ପ୍ରାଇମର୍ କ୍ରମଗୁଡିକ ଲେପନ କରିବା ଏବଂ ଜୋନ୍ 2 କୁ DNA କ୍ରମକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରିବା ଅଦଳବଦଳ ଅଟେ, ଏବଂ ବ୍ଲାଷ୍ଟ୍ ସଂପୃକ୍ତ, ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସମ୍ଭାବନାକୁ ଗଣନା କରେ, ତେଣୁ ଉପଭୋକ୍ତାମାନେ ଉଭୟ ଶୃଙ୍ଖଳା ଅର୍ଥ ଶୃଙ୍ଖଳା କି ନୁହେଁ ତାହା ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଆବଶ୍ୟକ କରନ୍ତି ନାହିଁ |ଯଦି ଆପଣ ଡାଟାବେସରେ କ୍ରମର GI ନମ୍ବର ଜାଣନ୍ତି ତେବେ ଆପଣ GI ନମ୍ବର ମଧ୍ୟ ପ୍ରବେଶ କରିପାରିବେ, ତେଣୁ ଆପଣଙ୍କୁ କ୍ରମର ଏକ ବଡ଼ ବିଭାଗ ଲେପନ କରିବାକୁ ପଡିବ ନାହିଁ |ଶେଷରେ, ଲକ୍ଷ୍ୟ DNA ରେ ପ୍ରାଇମରର ଏକାଧିକ ହୋମୋଲୋଜି ସାଇଟ୍ ଅଛି କି ନାହିଁ ଦେଖିବା ପାଇଁ 3 ରେ ଆଲାଇନ୍ କ୍ଲିକ୍ କରନ୍ତୁ |
6. ପ୍ରାଥମିକ ଟର୍ମିନାଲ୍ |
ପ୍ରାଇମରର 3 'ଶେଷ ହେଉଛି ଯେଉଁଠାରେ ବିସ୍ତାର ଆରମ୍ଭ ହୁଏ, ତେଣୁ ସେଠାରୁ ଆରମ୍ଭରୁ ଅସଙ୍ଗତିକୁ ରୋକିବା ଜରୁରୀ |3 'ଶେଷ କ୍ରମାଗତ 3 G କିମ୍ବା C ରୁ ଅଧିକ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ, କାରଣ ଏହା G + C ସମୃଦ୍ଧ କ୍ରମ ଅଞ୍ଚଳରେ ଭୁଲ୍ ଭାବରେ ପ୍ରାଇମର୍ ସୃଷ୍ଟି କରିବ |ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର PCR (AS-PCR) ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବ୍ୟତୀତ 3 'ଶେଷ କ secondary ଣସି ଦଳୀୟ ଗଠନ ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ ନାହିଁ, ପ୍ରାଇମରର 3 ′ ଶେଷ ମେଳ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଯଦି ଏନକୋଡିଂ ଅଞ୍ଚଳ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥାଏ, ତେବେ ପ୍ରାଇମର 3 'ଶେଷକୁ କୋଡନର ତୃତୀୟ ସ୍ଥିତିରେ ସମାପ୍ତ କରାଯିବା ଉଚିତ ନୁହେଁ, କାରଣ କୋଡନର ତୃତୀୟ ସ୍ଥିତି ଅବନତି ହେବାର ସମ୍ଭାବନା ଥାଏ, ଯାହା ବିସ୍ତାରର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ |ଆନେକ୍ସେସନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାବେଳେ, କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହାର ସାରଣୀକୁ ଅନୁସରଣ କରନ୍ତୁ, ଜ ological ବିକ ପସନ୍ଦ ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ, 3 ′ ଶେଷରେ ଆନେକ୍ସେସନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ନାହିଁ ଏବଂ ପ୍ରାଇମରର ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତା (1uM-3uM) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
7. ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକର ଦ୍ Secondary ିତୀୟ ଗଠନ |
ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ନିଜେ ସଂପୃକ୍ତ କ୍ରମଗୁଡିକ ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ, ନଚେତ୍ ପ୍ରାଇମର୍ମାନେ ନିଜେ ହେୟାରପିନ ସଂରଚନାରେ ଫୋଲ୍ଡ୍ ହୋଇଯିବେ, ଏବଂ ଏହି ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନଟି ଷ୍ଟେରିକ୍ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ହେତୁ ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟର ବନ୍ଧନକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିବ |ଯଦି କୃତ୍ରିମ ବିଚାର ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ନିଜେ ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକର କ୍ରମାଗତ ସଂପନ୍ନ ଆଧାର 3bp ରୁ ଅଧିକ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |ଦୁଇଟି ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ କ complement ଣସି ପରିପକ୍ୱତା ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ, ବିଶେଷତ prim ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଗଠନକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ 3 'ଏଣ୍ଡର ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଓଭରଲେପ୍ କୁ ଏଡାଇବା ଉଚିତ |ସାଧାରଣତ ,, ଏକ ଯୁଗଳ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ କ୍ରମାଗତ 4 ରୁ ଅଧିକ ବେସ୍ ହୋମୋଲୋଜି କିମ୍ବା ସଂପନ୍ନତା ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |
8. ମାର୍କର କିମ୍ବା ଲୋକୀ ଯୋଡନ୍ତୁ |
'' ଏଣ୍ଡର ଏମ୍ପ୍ଲାଇସିଫିକେସନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଉପରେ କମ୍ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ ଏବଂ ତେଣୁ ଏମ୍ପ୍ଲାଇସିଫିକେସନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ପ୍ରଭାବିତ ନକରି ପରିବର୍ତ୍ତିତ କରାଯାଇପାରେ |ପ୍ରାଇମର୍ '' ଶେଷର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ: ଏନଜାଇମ୍ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସାଇଟ୍ ଯୋଡିବା;ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ବାୟୋଟିନ୍, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ, ଡିଗୋକ୍ସିନ୍, ଇୟୁ 3 + ଇତ୍ୟାଦି ପ୍ରୋଟିନ୍ ବାନ୍ଧୁଥିବା DNA କ୍ରମକୁ ଉପସ୍ଥାପନ କର;ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ସାଇଟଗୁଡିକର ପରିଚୟ ଦେବା, ମ୍ୟୁଟେସନ୍ କ୍ରମଗୁଡିକ ସନ୍ନିବେଶ ଏବଂ ଅନୁପସ୍ଥିତ କରିବା ଏବଂ ପ୍ରୋମୋଟର୍ କ୍ରମଗୁଡିକ ଉପସ୍ଥାପନ କରିବା ଇତ୍ୟାଦି ଅତିରିକ୍ତ ଆଧାରଗୁଡ଼ିକ ବର୍ଦ୍ଧିତତାର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତାକୁ ଅଧିକ ପ୍ରଭାବିତ କରିବ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଗଠନର ସମ୍ଭାବନାକୁ ବ increase ାଇବ, କିନ୍ତୁ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପଦକ୍ଷେପ ପାଇଁ କିଛି ରିହାତି ଦେବାକୁ ପଡିବ |ଅତିରିକ୍ତ କ୍ରମ ଯାହା ଲକ୍ଷ୍ୟ କ୍ରମରେ ବିଦ୍ୟମାନ ନାହିଁ, ଯେପରି ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସାଇଟ ଏବଂ ପ୍ରୋମୋଟର୍ କ୍ରମ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ପ୍ରଭାବିତ ନକରି ପ୍ରାଇମର 5 ′ ଶେଷରେ ଯୋଗ କରାଯାଇପାରିବ |ଏହି କ୍ରମଗୁଡିକ ପ୍ରାଥମିକ Tm ମୂଲ୍ୟର ଗଣନାରେ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ ନୁହେଁ, କିନ୍ତୁ ପରିପକ୍ୱତା ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦଳୀୟ ଗଠନ ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷା କରାଯିବା ଉଚିତ |
9. ସବ୍କ୍ଲୋନ୍ |
ଅଧିକାଂଶ ସମୟ, PCR କେବଳ ପ୍ରାଥମିକ କ୍ଲୋନିଂ ଅଟେ, ଏବଂ ତାପରେ ଆମକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଖଣ୍ଡକୁ ବିଭିନ୍ନ ଭେକ୍ଟରରେ ସବ୍କ୍ଲୋନ୍ କରିବାକୁ ପଡିବ, ତେଣୁ PCR ପଦକ୍ଷେପରେ ପରବର୍ତ୍ତୀ କାର୍ଯ୍ୟ ପାଇଁ ଆମକୁ ଅତିରିକ୍ତ ଆଧାର ଡିଜାଇନ୍ କରିବାକୁ ପଡିବ |
ସବ୍କ୍ଲୋନିଂ ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା କିଛି କ୍ରମ ନିମ୍ନରେ ସଂକ୍ଷିପ୍ତ ହୋଇଛି |
ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଏଣ୍ଡୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସାଇଟ୍ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |
ଏନଜାଇମ୍ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସାଇଟଗୁଡିକ ଯୋଡିବା ହେଉଛି PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ସବ୍କ୍ଲୋନିଂ ପାଇଁ ସାଧାରଣତ used ବ୍ୟବହୃତ ପଦ୍ଧତି |ସାଧାରଣତ ,, କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟ୍ ଛଅଟି ବେସ୍ ଅଟେ, ଏହା ବ୍ୟତୀତ କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟର 5 'ଶେଷ ସହିତ 2 ~ 3 ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଆଧାର ଯୋଡିବା ଆବଶ୍ୟକ |ତଥାପି, ବିଭିନ୍ନ ଏନଜାଇମ୍ ଦ୍ୱାରା ଆବଶ୍ୟକ ସଂରକ୍ଷଣ ଭିତ୍ତି ସଂଖ୍ୟା ଭିନ୍ନ ଅଟେ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, SalⅠ କ prot ଣସି ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଆଧାର ଆବଶ୍ୟକ କରେ ନାହିଁ, EcoRⅤ 1 ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଆଧାର ଆବଶ୍ୟକ କରେ, NotⅠ 2 ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଆଧାର ଆବଶ୍ୟକ କରେ, ଏବଂ ହିନ୍ଦ 3 ଟି ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଆଧାର ଆବଶ୍ୟକ କରେ |
LIC ଲାଞ୍ଜ ଯୋଗ କରେ |
LIC ର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ନାମ ହେଉଛି ଲିଗେସନ୍-ସ୍ Independ ାଧୀନ କ୍ଲୋନିଂ, ଏକ କ୍ଲୋନିଂ ପଦ୍ଧତି ଯାହାକି ନାଭୋଜେନ ଦ୍ୱାରା ବିଶେଷ ଭାବରେ ଏହାର ପେଟିଏମ୍ ଭେକ୍ଟରର ଅଂଶ ପାଇଁ ଉଦ୍ଭାବିତ |LIC ପଦ୍ଧତି ଦ୍ prepared ାରା ପ୍ରସ୍ତୁତ ପେଟିଏମ୍ ବାହକରେ ଅଣ-ସଂପୃକ୍ତ 12-15 ବେସ୍ ସିଙ୍ଗଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ଷ୍ଟିକି ଏଣ୍ଡ୍ ଅଛି, ଯାହା ଟାର୍ଗେଟ୍ ଇନ୍ସର୍ଟ ଖଣ୍ଡରେ ସଂପୃକ୍ତ ଷ୍ଟିକି ଶେଷକୁ ପୂର୍ଣ୍ଣ କରେ |ବିସ୍ତାର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ପାଇଁ, ଭର୍ତ୍ତି ହୋଇଥିବା ଖଣ୍ଡର ପ୍ରାଇମର୍ 5 ′ କ୍ରମ LIC ଭେକ୍ଟରକୁ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ କରିବା ଉଚିତ |T4 DNA ପଲିମେରେଜ୍ ର 3 ′ → 5 ′ ଅତିରିକ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଳ୍ପ ସମୟ ପରେ ଭର୍ତ୍ତି ହୋଇଥିବା ଖଣ୍ଡ ଉପରେ ଏକ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ଷ୍ଟିକି ଏଣ୍ଡ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ |କାରଣ ଉତ୍ପାଦଟି କେବଳ ପ୍ରସ୍ତୁତ ସନ୍ନିବେଶ ଖଣ୍ଡ ଏବଂ ଭେକ୍ଟରର ପାରସ୍ପରିକ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ରୁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରିବ, ଏହି ପଦ୍ଧତିଟି ବହୁତ ଦ୍ରୁତ ଏବଂ ଦକ୍ଷ, ଏବଂ ଏହା କ୍ଲୋନିଂ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ |
ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ TA କ୍ଲୋନ୍ ଲାଞ୍ଜ ଯୋଗ କରେ |
TA କ୍ଲୋନିଂ ଖଣ୍ଡକୁ ଏକ ଭେକ୍ଟରରେ ଟାର୍ଗେଟ କରିବାରେ ଅସମର୍ଥ ହେଲା, ତେଣୁ ପରେ ଇନଭାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ଏକ ଭେକ୍ଟର ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କଲେ ଯାହା କ୍ଲୋନିଂକୁ ଟାର୍ଗେଟ କରିପାରିବ, ଯେଉଁଥିରେ ଗୋଟିଏ ପ୍ରାନ୍ତରେ ଚାରୋଟି ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ GTGGS ରହିଥିଲା |ତେଣୁ, PCR ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକର ଡିଜାଇନ୍ରେ, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ କ୍ରମଗୁଡିକ ସେହି ଅନୁଯାୟୀ ଯୋଡାଯିବା ଉଚିତ, ଯାହାଫଳରେ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ “ଆଭିମୁଖ୍ୟ” ହୋଇପାରିବ |
ଯଦି ତୁମେ ସମୟ ଉପରେ ଅଳ୍ପ, ତୁମେ ସିଧାସଳଖ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଚେଷ୍ଟା କରିପାରିବ, ଜିନ୍ କୁ ଭେକ୍ଟର ସହିତ ମିଶାଇ ପାରିବ, ଯାହାକୁ ଆମେ ମ୍ୟୁଜେକ୍ୟୁଲିଷ୍ଟରେ ET ଜିନ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ବୋଲି କହିଥାଉ |
D. ଇନ୍-ଫ୍ୟୁଜନ୍ କ୍ଲୋନିଂ ପଦ୍ଧତି |
କ lig ଣସି ଲିଗେଜ୍ ଆବଶ୍ୟକ ନାହିଁ, ଲମ୍ବା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଆବଶ୍ୟକ ନାହିଁ |ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ର line ଖିକ ଭେକ୍ଟରର ଉଭୟ ମୁଣ୍ଡରେ ଏକ କ୍ରମ ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ ହୋଇଛି, ପ୍ରାଇମରର ଡିଜାଇନ୍ରେ, ସେତେବେଳେ PCR ଉତ୍ପାଦ ଏବଂ ର ar ଖିକ ଭେକ୍ଟରକୁ BSA ଧାରଣ କରିଥିବା ଇନ୍-ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଏନଜାଇମ୍ ସମାଧାନରେ ଯୋଡାଯାଏ ଏବଂ ଅଧ ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ରଖାଯାଏ, ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇପାରିବ |ବୃହତ ଭଲ୍ୟୁମ୍ ରୂପାନ୍ତର ପାଇଁ ଏହି ପଦ୍ଧତି ବିଶେଷ ଉପଯୁକ୍ତ |
10. ପ୍ରାଇମର୍ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |
ବେଳେବେଳେ, କେବଳ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ବିଷୟରେ କେବଳ ସୀମିତ କ୍ରମ ସୂଚନା ଜଣାଶୁଣା |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଯଦି କେବଳ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମ ଜଣାଶୁଣା, ମିଶ୍ରଣ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇପାରିବ |ଏକ ମିଶ୍ରଣ ପ୍ରାଇମର୍ ହେଉଛି ବିଭିନ୍ନ କ୍ରମର ମିଶ୍ରଣ ଯାହା ସମସ୍ତ ଭିନ୍ନ ମୂଳ ସମ୍ଭାବନାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ ଯାହା ଗୋଟିଏ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଏନକୋଡ୍ କରେ |ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବ To ାଇବାକୁ, ବିଭିନ୍ନ ଜୀବଙ୍କ ଆଧାର ବ୍ୟବହାର ପସନ୍ଦ ଅନୁଯାୟୀ ଆନେ୍ଦାଳନକୁ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ଆପଣ କୋଡନ୍ ବ୍ୟବହାର ସାରଣୀକୁ ଅନୁସରଣ କରିପାରିବେ |ପ୍ରାଇମରର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ହାଇପୋକ୍ସାଣ୍ଟାଇନ୍ ସମସ୍ତ ଆଧାର ସହିତ ଯୋଡି ହୋଇପାରେ |ପ୍ରାଇମରର ′ ′ ଶେଷରେ ଆନେକ୍ସଡ୍ ବେସ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ନାହିଁ କାରଣ ଭୁଲ ସାଇଟରେ PCR ଆରମ୍ଭ କରିବା ପାଇଁ 3 ′ ଶେଷରେ ଶେଷ 3 ବେସର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ଯଥେଷ୍ଟ |ଉଚ୍ଚ ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା (1μM ରୁ 3μM) ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ କାରଣ ଅନେକ ଆନେ୍ଦାଳନ ମିଶ୍ରଣରେ ଥିବା ପ୍ରାଇମର୍ଗୁଡ଼ିକ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନୁହେଁ |
PCR କଞ୍ଚାମାଲ |ନିୟନ୍ତ୍ରଣ
1. ପ୍ରାଥମିକ ପରିମାଣ
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଇମରର ଏକାଗ୍ରତା ହେଉଛି 0.1 ~ 1umol କିମ୍ବା 10 ~ 100pmol |ସର୍ବନିମ୍ନ ପରିମାଣର ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ ଆବଶ୍ୟକ ଫଳାଫଳ ଉତ୍ପାଦନ କରିବା ଭଲ |ପ୍ରାଇମରର ଏକାଗ୍ରତା ଅସଙ୍ଗତି ଏବଂ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ଘଟାଇବ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ଡାଇମର୍ ସୃଷ୍ଟି କରିବାର ସୁଯୋଗ ବ increase ାଇବ |
2. ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା |
ପ୍ରାଥମିକମାନଙ୍କର ଏକାଗ୍ରତା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ସର୍ବୋତ୍କୃଷ୍ଟ ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା ସାଧାରଣତ 0.1 0.1 ରୁ 0.5μM ମଧ୍ୟରେ ଥାଏ |ଉଚ୍ଚ ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା ଅଜ୍ଞାତ ଦ୍ରବ୍ୟର ବିସ୍ତାରକୁ ନେଇଥାଏ |
3. ପ୍ରାଥମିକର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା |
ପ୍ରାଇମର୍ ପାଇଁ ଅନ୍ୟ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାରାମିଟର ହେଉଛି ତରଳିବା ତାପମାତ୍ରା (Tm) |ଏହା ହେଉଛି ତାପମାତ୍ରା ଯେତେବେଳେ 50% ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ କ୍ରମଗୁଡିକ ଦ୍ୱିଗୁଣିତ DNA ଅଣୁ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୁଏ |PCR ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ସେଟ୍ କରିବାକୁ Tm ଆବଶ୍ୟକ |ଆଦର୍ଶରେ, ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମ ସହିତ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକର ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ଯଥେଷ୍ଟ କମ୍, କିନ୍ତୁ ଅଜ୍ଞାତ ବନ୍ଧନକୁ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ |55 ℃ ରୁ 70 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା |ଆନିଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ସାଧାରଣତ T Tm ପ୍ରାଇମର୍ ଠାରୁ 5 ℃ କମ୍ ସେଟ୍ ହୋଇଛି |
Tm ସେଟିଂ ପାଇଁ ଅନେକ ସୂତ୍ର ଅଛି, ଯାହା ବ୍ୟବହୃତ ସୂତ୍ର ଏବଂ ପ୍ରାଇମର କ୍ରମ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ବହୁତ ଭିନ୍ନ ହୋଇଥାଏ |କାରଣ ଅଧିକାଂଶ ସୂତ୍ର ଏକ ଆନୁମାନିକ Tm ମୂଲ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରିଥାଏ, ସମସ୍ତ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା କେବଳ ଏକ ପ୍ରାରମ୍ଭ ବିନ୍ଦୁ |ଅନେକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଉନ୍ନତ ହୋଇପାରିବ ଯାହା ଧୀରେ ଧୀରେ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ବ raise ାଇଥାଏ |ଆନୁମାନିକ Tm-5 below ତଳେ ଆରମ୍ଭ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ଧୀରେ ଧୀରେ 2 of ବୃଦ୍ଧିରେ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ |ଉଚ୍ଚ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଏବଂ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଦ୍ରବ୍ୟର ଗଠନକୁ ହ୍ରାସ କରିବ |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଫଳାଫଳ ପାଇଁ, ଦୁଇଟି ପ୍ରାଥମିକରେ ଆନୁମାନିକ Tm ମୂଲ୍ୟ ରହିବା ଉଚିତ |ଯଦି ପ୍ରାଇମର୍ ଯୁଗଳଗୁଡିକର Tm ପାର୍ଥକ୍ୟ 5 more ରୁ ଅଧିକ, ପ୍ରାଥମିକମାନେ ଚକ୍ରରେ ଏକ କମ୍ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ମହତ୍ false ପୂର୍ଣ୍ଣ ମିଥ୍ୟା ଆରମ୍ଭ ଦେଖାଇବେ |ଯଦି ଦୁଇଟି ପ୍ରାଇମର୍ Tm ଅଲଗା, ସର୍ବନିମ୍ନ Tm ଠାରୁ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା 5 ℃ କମ୍ ସେଟ୍ କରନ୍ତୁ |ବ ly କଳ୍ପିକ ଭାବରେ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବ to ାଇବାକୁ, ଉଚ୍ଚ Tm ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ପ୍ରଥମେ ପାଞ୍ଚଟି ଚକ୍ର ସଂପାଦିତ ହୋଇପାରିବ, ଏବଂ ଅବଶିଷ୍ଟ ଚକ୍ରଗୁଡିକ ନିମ୍ନ Tm ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ |ଏହା କଠିନ ପରିସ୍ଥିତିରେ ଲକ୍ଷ୍ୟସ୍ଥଳ ଟେମ୍ପଲେଟର ଏକ ଆଂଶିକ କପି ପାଇବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |
4. ପ୍ରାଥମିକ ଶୁଦ୍ଧତା ଏବଂ ସ୍ଥିରତା |
ଅଧିକାଂଶ PCR ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ କଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକର ମାନକ ଶୁଦ୍ଧତା ଯଥେଷ୍ଟ |ବେନଜୋଏଲ୍ ଏବଂ ଆଇସୋବୁଟିଲିଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀକୁ ଡିଜାଲ୍ କରି ଅପସାରଣ ସର୍ବନିମ୍ନ ଏବଂ ତେଣୁ PCR ରେ ହସ୍ତକ୍ଷେପ କରେ ନାହିଁ |ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଯେକ any ଣସି ପୂର୍ଣ୍ଣ-ଲମ୍ବ କ୍ରମକୁ ହଟାଇବା ପାଇଁ କିଛି ପ୍ରୟୋଗ ଶୁଦ୍ଧତା ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଏହି ଛୋଟ କ୍ରମଗୁଡିକ ଘଟିଥାଏ କାରଣ DNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନର ଦକ୍ଷତା 100% ନୁହେଁ |ଏହା ଏକ ବୃତ୍ତାକାର ପ୍ରକ୍ରିୟା ଯାହା ବାରମ୍ବାର ରାସାୟନିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରେ କାରଣ 3 ′ ରୁ 5 ′ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ DNA ତିଆରି କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆଧାର ଯୋଗ କରାଯାଇଥାଏ |ଆପଣ ଉଭୟ ଚକ୍ରରେ ବିଫଳ ହୋଇପାରିବେ |ଲମ୍ବା ପ୍ରାଇମର୍, ବିଶେଷତ those 50 ରୁ ଅଧିକ ବେସ୍, ଛୋଟ କ୍ରମର ଏକ ବଡ଼ ଅଂଶ ଅଛି ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ଆବଶ୍ୟକ କରିପାରନ୍ତି |
ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ରସାୟନ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧକରଣ ପ୍ରଣାଳୀର ଦକ୍ଷତା ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାଇମର ଅମଳ ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ |ବାୟୋଫାର୍ମାସ୍ୟୁଟିକାଲ୍ କମ୍ପାନୀଗୁଡିକ, ଯେପରିକି ସାଇଟୋଲୋଜି ଏବଂ ସେଙ୍ଗଙ୍ଗ, ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏସାଇଡ୍ ର ମୋଟ ଉତ୍ପାଦନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ ସର୍ବନିମ୍ନ OD ୟୁନିଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତି |କଷ୍ଟମ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଶୁଖିଲା ପାଉଡର ଆକାରରେ ପଠାଯାଏ |TE ରେ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକୁ ପୁନ iss ସମାଧାନ କରିବା ଭଲ, ଯାହାଫଳରେ ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତା 100μM ହେବ |ଡିଓନାଇଜଡ୍ ଜଳ ଅପେକ୍ଷା TE ଭଲ କାରଣ ଜଳର pH ପ୍ରାୟତ acid ଅମ୍ଳଯୁକ୍ତ ଏବଂ ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏସାଇଡ୍ସର ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିବ |
ପ୍ରାଥମିକ ସ୍ଥିତିକୁ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ଅବସ୍ଥା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ |ଶୁଖିଲା ପାଉଡର ଏବଂ ଦ୍ରବୀଭୂତ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ -20 at ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯିବା ଉଚିତ |10μM ରୁ ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତାରେ TE ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ 6 ମାସ ପାଇଁ -20 at ରେ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରିବ, କିନ୍ତୁ କେବଳ 1 ସପ୍ତାହରୁ କମ୍ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ (15 ℃ ରୁ 30 ℃) ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରିବ |ଶୁଖିଲା ପାଉଡର ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ -20 C ରେ ଅତି କମରେ 1 ବର୍ଷ ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ (15 C ରୁ 30 C) 2 ମାସ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରିବ |
5. ଏନଜାଇମ୍ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଏକାଗ୍ରତା |
ବର୍ତ୍ତମାନ ବ୍ୟବହୃତ ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ହେଉଛି ମୂଳତ col କୋଲିଫର୍ମ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆ ଦ୍ୱାରା ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଜିନ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ଏନଜାଇମ୍ |ଏକ ସାଧାରଣ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଏନଜାଇମର ପରିମାଣ ପ୍ରାୟ 2.5U (100ul ର ମୋଟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣକୁ ସୂଚିତ କରେ) |ଯଦି ଏକାଗ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ ଅଧିକ, ଏହା ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାରକୁ ନେଇପାରେ;ଯଦି ଏକାଗ୍ରତା ବହୁତ କମ୍, ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ଉତ୍ପାଦର ପରିମାଣ ହ୍ରାସ ପାଇବ |
6. dNTP ର ଗୁଣ ଏବଂ ଏକାଗ୍ରତା |
DNTP ର ଗୁଣବତ୍ତା ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ PCR ବିସ୍ତାରର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ସହିତ ନିବିଡ ଭାବରେ ଜଡିତ |DNTP ପାଉଡର ଗ୍ରାନୁଲାର୍ ଅଟେ, ଏବଂ ଯଦି ଏହାର ଭୁଲ୍ ସଂରକ୍ଷିତ ହୁଏ ତେବେ ଏହାର ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳତା ଜ bi ବିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ହରାଇଥାଏ |dNTP ସମାଧାନ ଅମ୍ଳୀୟ, ଏବଂ ଏହାର ଏକାଗ୍ରତାରେ 1M NaOH କିମ୍ବା 1M Tris.HCL ବଫର୍ ସମାଧାନ ସହିତ ଏହାର PH କୁ 7.0 ~ 7.5, ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର ସବ୍-ପ୍ୟାକେଜିଂ, -20 at ରେ ଫ୍ରିଜ୍ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ସହିତ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଉଚିତ |ଏକାଧିକ ଫ୍ରିଜ୍-ଥୱିଙ୍ଗ୍ dNTP କୁ ଖରାପ କରିବ |PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ, dNTP 50 ~ 200umol / L ହେବା ଉଚିତ |ବିଶେଷକରି, ଚାରୋଟି DNTPS ର ଏକାଗ୍ରତା ପ୍ରତି ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଉଚିତ୍ (ସମାନ ମୋଲ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତି) |ଯଦି ସେମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ କ one ଣସିଟିର ଏକାଗ୍ରତା ଅନ୍ୟମାନଙ୍କଠାରୁ ଭିନ୍ନ (ଉଚ୍ଚ କିମ୍ବା ନିମ୍ନ), ଅସଙ୍ଗତି ଘଟିବ |ଅତ୍ୟଧିକ ଏକାଗ୍ରତା PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ଅମଳ ହ୍ରାସ କରିବ |dNTP Mg2 + ସହିତ ମିଶି ମାଗଣା Mg2 + ର ଏକାଗ୍ରତା ହ୍ରାସ କରିପାରିବ |
7. ଟେମ୍ପଲେଟ୍ (ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍) ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ |
ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ର ପରିମାଣ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ଡିଗ୍ରୀ ହେଉଛି PCR ର ସଫଳତା କିମ୍ବା ବିଫଳତା ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ଲିଙ୍କ୍ |ପାରମ୍ପାରିକ ଡିଏନ୍ଏ ଶୁଦ୍ଧକରଣ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକ ସାଧାରଣତ SD ନମୁନାଗୁଡିକ ହଜମ ଏବଂ ବିସର୍ଜନ କରିବା ପାଇଁ SDS ଏବଂ ପ୍ରୋଟିସ୍ କେ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତି |SDS ର ମୁଖ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି: କୋଷର ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଉପରେ ଲିପିଡସ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ ତରଳାଇ ଦିଅନ୍ତୁ, ଯାହା ଦ୍ mem ାରା ମେମ୍ବ୍ରବାନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡ଼ିକ ଦ୍ cell ାରା କୋଷର ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ନଷ୍ଟ ହୋଇଯାଏ ଏବଂ କୋଷରେ ଆଣବିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ହୁଏ, SDS ମଧ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ମିଶିପାରେ;ପ୍ରୋଟିନ୍ କେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ ଏବଂ ହଜମ କରିପାରିବ, ବିଶେଷତ D DNA ସହିତ ବନ୍ଧା ହୋଇଥିବା ହିଷ୍ଟୋନ୍, ଏବଂ ତାପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କୋଷ ଉପାଦାନ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଜ organic ବ ଦ୍ରବଣକାରୀ ଫେନୋଲ୍ ଏବଂ କ୍ଲୋରୋଫର୍ମ ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ନିର୍ଗତ କରିବା ପାଇଁ ଇଥାନଲ୍ କିମ୍ବା ଆଇସୋପ୍ରୋପିଲ୍ ଆଲକୋହଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବ |ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ |ସାଧାରଣ କ୍ଲିନିକାଲ୍ ଚିହ୍ନଟ ନମୁନା ପାଇଁ, ଏକ ଶୀଘ୍ର ଏବଂ ସରଳ ପଦ୍ଧତି କୋଷଗୁଡିକ ତରଳାଇବା, ଲାଇସେଟ୍ ପାଥୋଜେନ, କ୍ରୋମୋଜୋମରୁ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ହଜମ କରିବା ଏବଂ ଅପସାରଣ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ PCR ବିସ୍ତାର ପାଇଁ ସିଧାସଳଖ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ନିଷ୍କାସନ ସାଧାରଣତ gu ଗୁଆନାଡାଇନ୍ ଆଇସୋଥାଇଓସିୟାନେଟ୍ କିମ୍ବା ପ୍ରୋଟେଜ୍ କେ ପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରି RNase କୁ RNA କୁ ଖରାପ ନକରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରିଥାଏ |
8.Mg2 + ଏକାଗ୍ରତା |
PCR ବିସ୍ତାରର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ଅମଳ ଉପରେ Mg2 + ର ଏକ ମହତ୍ effect ପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ଅଛି |ସାଧାରଣ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ, ଯେତେବେଳେ ବିଭିନ୍ନ dNTP ର ଏକାଗ୍ରତା 200umol / L, Mg2 + ର ଉପଯୁକ୍ତ ଏକାଗ୍ରତା 1.5 ~ 2.0mmol / L ଅଟେ |Mg2 + ଏକାଗ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ ଅଧିକ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ହ୍ରାସ ହୁଏ, ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାର ହୁଏ, ଅତ୍ୟଧିକ କମ୍ ଏକାଗ୍ରତା Taq DNA ପଲିମେରେଜ୍ ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ହ୍ରାସ କରିବ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକ ହ୍ରାସ ପାଇବ |
ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ PCR ର ଅନେକ ଦିଗକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିଥାଏ, ଯେପରିକି DNA ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ, ଯାହା ଅମଳ ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ଅନ୍ୟ ଏକ ଉଦାହରଣ ହେଉଛି ପ୍ରାଇମର୍ ଆନ୍ଲିଙ୍ଗ୍, ଯାହା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |dNTP ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ ସହିତ ବାନ୍ଧେ, ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ମାଗଣା ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନର ପରିମାଣକୁ ହ୍ରାସ କରେ |ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରାଇମର୍ ଯୁଗଳ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପାଇଁ ସର୍ବୋଚ୍ଚ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନର ଏକାଗ୍ରତା ଭିନ୍ନ ହୋଇଥାଏ, କିନ୍ତୁ 200μM dNTP ସହିତ ଏକ ସାଧାରଣ PCR ଆରମ୍ଭ ଏକାଗ୍ରତା ହେଉଛି 1.5 ମିମି (ଟିପନ୍ତୁ: ରିଅଲ୍ ଟାଇମ୍ ପରିମାଣିକ PCR ପାଇଁ, ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋବ ସହିତ 3 ରୁ 5 ମିଟର ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ ସମାଧାନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ) |ମାଗଣା ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନର ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତା ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି କରେ, କିନ୍ତୁ ଅଜ୍ଞାତ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ବିଶ୍ id ସ୍ତତା ହ୍ରାସ କରେ |ସର୍ବୋତ୍କୃଷ୍ଟ ଏକାଗ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ, ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆଇନ୍ ଟାଇଟ୍ରେସନ୍ m। M ମିଟରରୁ m ୦୦ ମିଟର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳତା ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଅପେକ୍ଷା ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନର ଏକାଗ୍ରତା ଉପରେ କାର୍ଯ୍ୟ ବଜାୟ ରଖିବାରେ ସକ୍ଷମ ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ କମ୍ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |
9. Pcr- ପ୍ରୋତ୍ସାହନ ଯୋଗୀ |
ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା, ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍, ଏବଂ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନର ଏକାଗ୍ରତା ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଅଧିକାଂଶ ଟେମ୍ପଲେଟର ଉଚ୍ଚ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ |ତଥାପି, କିଛି ଟେମ୍ପଲେଟ୍, ଉଚ୍ଚ ଜିସି ବିଷୟବସ୍ତୁ ସହିତ, ଅତିରିକ୍ତ ପଦକ୍ଷେପ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଡିଏନ୍ଏର ତରଳିବା ତାପମାତ୍ରାକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରୁଥିବା ପଦାର୍ଥଗୁଡ଼ିକ ଉତ୍ପାଦର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ଅମଳର ଉନ୍ନତି ପାଇଁ ଅନ୍ୟ ଏକ ଉପାୟ ପ୍ରଦାନ କରେ |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଫଳାଫଳ ପାଇଁ ଟେମ୍ପଲେଟର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ବିଭାଜନ ଆବଶ୍ୟକ |
ଏହା ସହିତ, ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ପ୍ରାଥମିକ ବନ୍ଧନ ଏବଂ ଏନଜାଇମ୍ ବିସ୍ତାରକୁ ରୋକିଥାଏ |
ଫର୍ମାମାଇଡ୍, DMSO, ଗ୍ଲାଇସେରିନ୍, ବିଟାଏନ୍, ଏବଂ PCRx ଏନହାନ୍ସର୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ PCR ଯୋଗୀ, ବର୍ଦ୍ଧନକୁ ବ enhance ାଇଥାଏ |ସେମାନଙ୍କର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରଣାଳୀ ହେଉଛି ତରଳିବା ତାପମାତ୍ରାକୁ ହ୍ରାସ କରିବା, ଯାହା ଦ୍ prim ାରା ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକର ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ଏବଂ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ଅଞ୍ଚଳ ମାଧ୍ୟମରେ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ବିସ୍ତାରକୁ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |PCRx ସମାଧାନର ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସୁବିଧା ଅଛି |ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ଏବଂ ପ୍ଲାଟିନମ୍ Pfx DNA ପଲିମେରେଜ୍ ସହିତ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲେ ସର୍ବନିମ୍ନ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ |ଏହିପରି, ତୃତୀୟ ଆଭିମୁଖ୍ୟ, ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳତା ହ୍ରାସ କରୁଥିବାବେଳେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବ to ାଇବା ପାଇଁ ପ୍ଲାଟିନମ୍ କ techni ଶଳ ଯୋଗକ ସହିତ ମିଶ୍ରିତ |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଫଳାଫଳ ପାଇଁ, ଯୋଗର ଏକାଗ୍ରତାକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରାଯିବା ଉଚିତ, ବିଶେଷତ D DMSO, ଫର୍ମାମାଇଡ୍, ଏବଂ ଗ୍ଲାଇସେରୋଲ, ଯାହା Taq DNA ପଲିମେରାଜକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ |
ଫୋରେସି ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ |
10. ହଟ ଆରମ୍ଭ |
ଭଲ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ବ୍ୟତୀତ PCR ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିବା ପାଇଁ ହଟ୍ ଷ୍ଟାର୍ଟ PCR ହେଉଛି ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପଦ୍ଧତି |ଯଦିଓ Taq DNA ପଲିମେରେଜ୍ ର ସର୍ବୋଚ୍ଚ ବିସ୍ତାର ତାପମାତ୍ରା 72 is, ପଲିମେରେଜ୍ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ସକ୍ରିୟ ରହିଥାଏ |ଏହିପରି, PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରସ୍ତୁତି ସମୟରେ ଏବଂ ତାପଜ ଚକ୍ର ଆରମ୍ଭରେ ହୋଲ୍ଡିଂ ତାପମାତ୍ରା ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରାଠାରୁ କମ୍ ହେଲେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୁଏ |ଥରେ ଗଠନ ହୋଇଗଲେ, ଏହି ଅଜ୍ଞାତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥାଏ |ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ସାଇଟଗୁଡିକ ଜେନେଟିକ୍ ଉପାଦାନଗୁଡିକର ଅବସ୍ଥାନ ଦ୍ୱାରା ସୀମିତ, ଯେପରିକି ସାଇଟ୍-ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ମ୍ୟୁଟେସନ୍, ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ କ୍ଲୋନିଂ, କିମ୍ବା DNA ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଜେନେଟିକ୍ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ନିର୍ମାଣ ଏବଂ ମନିପ୍ୟୁଲେସନ୍ ପରି ହଟ୍-ଷ୍ଟାର୍ଟ PCR ବିଶେଷ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ |
Taq DNA ପଲିମେରେଜ୍ ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ସୀମିତ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ସାଧାରଣ ପଦ୍ଧତି ହେଉଛି ବରଫ ଉପରେ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ଏବଂ ଏହାକୁ ଏକ ଗରମ PCR ଉପକରଣରେ ରଖିବା |ଏହି ପଦ୍ଧତି ସରଳ ଏବଂ ଶସ୍ତା, କିନ୍ତୁ ଏହା ଏନଜାଇମର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ କରେ ନାହିଁ ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଦ୍ରବ୍ୟର ବିସ୍ତାରକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ରୂପେ ଦୂର କରେ ନାହିଁ |
ଥର୍ମାଲ୍ ପ୍ରିମିଙ୍ଗ୍ ଏକ ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ ଉପାଦାନକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କରି DNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ବିଳମ୍ବ କରେ ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ PCR ଉପକରଣଗୁଡ଼ିକ ଡେନାଟରେସନ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ପହଞ୍ଚେ |ଅଧିକାଂଶ ମାନୁଆଲ୍ ଥର୍ମାଲ୍ ପ୍ରାରମ୍ଭ ପ୍ରଣାଳୀ, ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ର ବିଳମ୍ବିତ ଯୋଗକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି, ବିଶେଷତ high ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୋପଟ୍ ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ କଷ୍ଟଦାୟକ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଥର୍ମାଲ୍ ପ୍ରିମିଙ୍ଗ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ଏକ ମହମ ଉପାଦାନକୁ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଆୟନ କିମ୍ବା ଏନଜାଇମ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ କିମ୍ବା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏବଂ ବଫର୍ ପରି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ ଶାରୀରିକ ଭାବରେ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ମହମ ield ାଲ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତି |ଥର୍ମାଲ୍ ଚକ୍ର ସମୟରେ, ମହମ ତରଳିଯିବା ସହିତ ବିଭିନ୍ନ ଉପାଦାନଗୁଡିକ ମୁକ୍ତ ହୋଇ ମିଶ୍ରିତ ହୁଏ |ମାନୁଆଲ୍ ହଟ୍ ଷ୍ଟାର୍ଟ ପଦ୍ଧତି ପରି, ମହମ ield ାଲ ପଦ୍ଧତି କଷ୍ଟଦାୟକ ଏବଂ ପ୍ରଦୂଷଣର ପ୍ରବୃତ୍ତି ଅଟେ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ଥ୍ରୋପଟ୍ ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ନୁହେଁ |
ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଗରମ ଆରମ୍ଭ PCR ପାଇଁ ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ସୁବିଧାଜନକ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ |ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ସହିତ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ମିଶ୍ରିତ |ଦୀର୍ଘ ସମୟର ତାପମାତ୍ରା ଧାରଣ ସମୟରେ ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିବା ପାଇଁ PCR ଦ୍ The ାରା ଆଣ୍ଟିବଡି ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥାଏ |ପୂର୍ଣ୍ଣ ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପୁନ oring ସ୍ଥାପିତ କରି ଡେନାଟୁରେସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍ ର 94 ℃ ଇନସୁଲେସନ୍ ସମୟରେ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ମୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଥର୍ମାଲ୍ ଆରମ୍ଭ ପାଇଁ ରାସାୟନିକ ରୂପାନ୍ତରିତ Taq DNA ପଲିମେରେଜ୍ ତୁଳନାରେ, ପଲିଥିନକୁ ସକ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଏନଜାଇମ୍ 94 ℃ (10 ରୁ 15 ମିନିଟ୍) ରେ ଦୀର୍ଘ ସମୟର ଇନସୁଲେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେନାହିଁ |ପ୍ଲାଟିନମ୍ ଟ୍ୟାକ୍ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ସହିତ, 90% Taq DNA ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ 94 at ରେ 2 ମିନିଟ୍ ପରେ ପୁନ restored ସ୍ଥାପିତ ହେଲା |
11. ନାଷ୍ଟ- PCR |
ନେଷ୍ଟେଡ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରି କ୍ରମାଗତ ରାଉଣ୍ଡ ବିସ୍ତାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିପାରିବ |ପ୍ରଥମ ରାଉଣ୍ଡ ହେଉଛି 15 ରୁ 20 ଚକ୍ରର ଏକ ମାନକ ବିସ୍ତାର |ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦର ଏକ ଛୋଟ ଭଗ୍ନାଂଶ 100 ରୁ 1000 ଥର ମିଶ୍ରିତ ହୋଇ 15 ରୁ 20 ଚକ୍ର ପାଇଁ ଦ୍ୱିତୀୟ ରାଉଣ୍ଡରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ବ ly କଳ୍ପିକ ଭାବରେ, ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦକୁ ଜେଲ୍ ଶୁଦ୍ଧକରଣ ଦ୍ୱାରା ଆକାର କରାଯାଇପାରିବ |ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ର ଏକ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଯାହା ପ୍ରଥମ ପ୍ରାଇମର୍ ଭିତରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମକୁ ବାନ୍ଧିପାରେ |ନେଷ୍ଟେଡ୍ PCR ର ବ୍ୟବହାର ଏକାଧିକ ଟାର୍ଗେଟ୍ ସାଇଟଗୁଡିକର ବୃଦ୍ଧି ହେବାର ସମ୍ଭାବନାକୁ ହ୍ରାସ କରିଥାଏ କାରଣ ଉଭୟ ପ୍ରାଇମର୍ ସେଟ୍ ପାଇଁ କିଛି ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମ ସଂପନ୍ନ |ସମାନ ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ ସମାନ ସମୁଦାୟ ଚକ୍ର (30 ରୁ 40) ଅଜ୍ଞାତ ସାଇଟଗୁଡିକୁ ବୃଦ୍ଧି କଲା |ନେଷ୍ଟେଡ୍ PCR ସୀମିତ ଲକ୍ଷ୍ୟ କ୍ରମର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବ increases ାଇଥାଏ (ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ବିରଳ mrnas) ଏବଂ କଠିନ PCRS ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିଥାଏ (ଯଥା 5 ′ RACE) |
12. PCR ତଳକୁ
PCR ଅବତରଣ PCR ର ପ୍ରଥମ କିଛି ଚକ୍ର ପାଇଁ କଠିନ ଆନ୍ଲିଙ୍ଗ୍ ଅବସ୍ଥା ବ୍ୟବହାର କରି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଉନ୍ନତ କରେ |ଚକ୍ରଟି ଆନୁମାନିକ Tm ଠାରୁ ପ୍ରାୟ 5 ℃ ଅଧିକ ତାପମାତ୍ରାରେ ଆରମ୍ଭ ହୁଏ, ତା’ପରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚକ୍ର 1 ℃ ରୁ 2 is ହ୍ରାସ ହୁଏ ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରା Tm 5 below ତଳେ ନଥାଏ |ସର୍ବୋଚ୍ଚ ହୋମୋଲୋଜି ସହିତ କେବଳ ଗନ୍ତବ୍ୟ ସ୍ଥଳ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବୃଦ୍ଧି କରାଯିବ |ଏହି ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଚକ୍ରରେ ବିସ୍ତାର କରିବାରେ ଲାଗିଛି, ବର୍ଦ୍ଧିତ ଅଜ୍ଞାତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକୁ ଭିଡ଼ କରି |ଅବତରଣ PCR ପଦ୍ଧତି ପାଇଁ ଉପଯୋଗୀ ଯେଉଁଠାରେ ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ହୋମୋଲୋଜିର ଡିଗ୍ରୀ ଜଣା ନାହିଁ, ଯେପରିକି AFLP DNA ଫିଙ୍ଗର ପ୍ରିଣ୍ଟିଙ୍ଗ୍ |
ସମ୍ବନ୍ଧିତ PCR କିଟ୍ |
2 × PCR ହିରୋ |TMମିକ୍ସ ସିଷ୍ଟମରେ ସାଧାରଣ PCR ମିକ୍ସ ସିଷ୍ଟମ ଅପେକ୍ଷା PCR ଇନହିବିଟର ପ୍ରତି ଅଧିକ ସହନଶୀଳତା ରହିଛି ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ଜଟିଳ ଟେମ୍ପଲେଟର PCR ବିସ୍ତାରକୁ ସହଜରେ ସମ୍ଭାଳି ପାରିବେ |ଅନନ୍ୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ-ଦକ୍ଷତା ଟ୍ୟାକ୍ ହିରୋ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଅଧିକ ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ସୃଷ୍ଟି କରେ |
ଉଚ୍ଚ ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା |
ଏଥିରେ 5 '→ 3' DNA ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ 5 '→ 3' ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି, 3 '→ 5' ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବିନା |
ରିଅଲ୍ ଟାଇମ୍ PCR Easyᵀᴹ-SYBR ସବୁଜ I କିଟ୍ |
ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ - ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ବଫର୍ ଏବଂ ହଟ-ଷ୍ଟାର୍ଟ ଟ୍ୟାକ୍ ଏନଜାଇମ୍ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାର ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଗଠନକୁ ରୋକିପାରେ |
ଉଚ୍ଚ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା - ଟେମ୍ପଲେଟର କମ୍ କପି ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ |
RT-PCR Easyᵀᴹ I (ଗୋଟିଏ ପଦକ୍ଷେପ)
କିଟ୍ ଏକ ନିଆରା ଫରେଜେନ୍ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ରିଜେଣ୍ଟ୍ ଏବଂ ଫୋରେଜେନ୍ ହଟଷ୍ଟାର୍ ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ନିଆରା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ସହିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିଥାଏ |
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ମେ -09-2023 |
