RT-qPCR ହେଉଛି ମଲିକୁଲାର ଜୀବବିଜ୍ଞାନର ମ basic ଳିକ ପରୀକ୍ଷଣ, ଏବଂ ସମସ୍ତେ ଏହା ସହିତ ପରିଚିତ ହେବା ଜରୁରୀ |ଏଥିରେ ମୁଖ୍ୟତ three ତିନୋଟି ସୋପାନ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ: RNA ନିଷ୍କାସନ, cDNA ରେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଏବଂ ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପରିମାଣିକ PCR |ଏହା ସାହାଯ୍ୟ କରେ ନାହିଁ, କଣ ଚାଲିଛି?ଏହା ସହିତ ଏକ ସମସ୍ୟା ଅଛି |ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ |!ଯଦିଓ ଏହା ଲାଗୁଛି ଯେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ କେବଳ RNA, dNTP, ପ୍ରାଇମର୍, ଏବଂ ଯୋଗ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ |ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଟ୍ୟୁବ୍ କୁ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶାନ୍ତୁ, କିନ୍ତୁ ପ୍ରକୃତ ଅପରେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ, ତଥାପି ଅନେକ ବିବରଣୀ ଅଛି ଯାହାକୁ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଆବଶ୍ୟକ |ଚାଲନ୍ତୁ ଏହା ବିଷୟରେ ଜାଣିବା!

RNA ର ଗୁଣବତ୍ତା କିପରି ବିଚାର କରିବେ?
CDNA ପାଇବା ପାଇଁ, RNA ର ଗୁଣ ଗୁରୁତର ଅଟେ!ମୁଖ୍ୟତ two ଦୁଇଟି ଦିଗରୁ RNA ଗୁଣ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ:
(1) RNA ଅଖଣ୍ଡତା:ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ R ାରା RNA ଅଖଣ୍ଡତା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇପାରିବ |. ଏକ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ ଇଉକାରିଓଟ୍ ଗ୍ରହଣ କଲେ, ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମୋଟ RNA ରେ ତିନୋଟି ସ୍ୱଚ୍ଛ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଅଛି, ବଡ଼ରୁ ଛୋଟ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ମଲିକୁଲାର ଓଜନ ହେଉଛି 28S, 18S, ଏବଂ 5S, ଏବଂ 28S 18S ଠାରୁ ଦୁଇଗୁଣ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ;ଯଦି ତିନୋଟି ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯାଏ, କିନ୍ତୁ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ପ୍ରକାର ଅସ୍ପଷ୍ଟ କିମ୍ବା ଡିଫ୍ୟୁଜନ୍ ଅର୍ଥାତ୍ RNA ଆଂଶିକ ଖରାପ ହୋଇଯାଏ |ଏହି ସମୟରେ, ଦୟାକରି ତୁରନ୍ତ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସଂପାଦନ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଇନପୁଟ୍ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ;ଯଦି କେବଳ ଏକ ଛୋଟ ମଲିକୁଲାର ଓଜନ ବିଶିଷ୍ଟ ଏକ ବ୍ୟାଣ୍ଡ କିମ୍ବା କ band ଣସି ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, ତେବେ RNA ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ଖରାପ ହୋଇଯାଇଛି ଏବଂ ଏହାକୁ ପୁନ - ବାହାର କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |Agilent 2100 ଶିଖର ଚିତ୍ର ଏବଂ RIN ମୂଲ୍ୟ ସହିତ RNA ର ଅଖଣ୍ଡତାକୁ ସୂଚିତ କରେ |ଯଦି ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ, ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫେରୋଗ୍ରାମର ମୂଳଦୁଆ ସମତଳ;ଯଦି ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ଗୁରୁତର ଭାବରେ ଖରାପ ହୋଇଯାଏ, ବେସ୍ ଲାଇନ୍ ଅସମାନ ଏବଂ ଅଧିକ ଅବକ୍ଷୟ ଶିଖର ଦେଖାଯାଏ;RIN ର ମୂଲ୍ୟ RNA ର ଅଖଣ୍ଡତାକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରେ, 0-10 ପରିସର ମଧ୍ୟରେ, ମୂଲ୍ୟ ଯେତେ ବଡ଼, RNA ର ଗୁଣ ସେତେ ଭଲ |ଠିକ୍, ସଂପୂର୍ଣ୍ଣତାର ଡିଗ୍ରୀ ଅଧିକ |
(୨) RNA ର ଶୁଦ୍ଧତା:UV ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରଫୋଟୋମିଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା OD260 / 280 ର ଅନୁପାତ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ |ଯଦି OD260 / 280 ର ଅନୁପାତ 1.9 ରୁ 2.1 ମଧ୍ୟରେ ଥାଏ, ତେବେ ଶୁଦ୍ଧତା ବହୁତ ଭଲ |
ଅବଶିଷ୍ଟ ଜେନୋମିକ୍ DNA ଭୁଲ୍ ପରିମାଣିକ ଫଳାଫଳକୁ ନେଇପାରେ |
ଯେତେବେଳେ RNA ବାହାର କରାଯାଏ, ଆମେ ପାଇଥିବା RNA ଜେନୋମିକ୍ DNA (gDNA) ସହିତ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇପାରେ ଯାହା ସଫା ହୋଇନାହିଁ |ତେଣୁ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପରେ cDNA ମଧ୍ୟ ମିଶ୍ରିତ ହେବ |gDNA।ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ସମୟରେ |qPCRପ୍ରତିକ୍ରିୟା,cDNAଏବଂ gDNA ଏକାସାଙ୍ଗରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇପାରେ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏକ ଅପେକ୍ଷାକୃତ ଛୋଟ CT ମୂଲ୍ୟ, ତେଣୁ ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ପକ୍ଷପାତ ହୋଇପାରେ |
ତେବେ ଏହି ପରିସ୍ଥିତିରେ ଆମେ କ’ଣ କରିବା?ଫରେଗେନ୍ |ପରାମର୍ଶ କରେ:
(1) ଓଲଟା RNA ଉପରେ ଜିନୋମ ସଫେଇ କାର୍ଯ୍ୟ କର, ଯାହା RNA ଉତ୍ତୋଳନ ସମୟରେ ସ୍ତମ୍ଭ ଉତ୍ତୋଳନ ଦ୍ୱାରା ଅପସାରଣ କରାଯାଇପାରିବ;
(୨) ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA କୁ DNase ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କର |I , କିନ୍ତୁ ଏହାକୁ EDTA ସହିତ ସମାପ୍ତ କରନ୍ତୁ;
ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ରିଜେଣ୍ଟସ୍ |ଜିନୋମ କ୍ଲିଅର୍ ମଡ୍ୟୁଲ୍ ସହିତ;

ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ କିପରି ବାଛିବେ?
ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ଫଳାଫଳକୁ ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବିତ କରେ |ପରୀକ୍ଷଣର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିସ୍ଥିତି ଅନୁଯାୟୀ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ଆପଣ ଅନିୟମିତ ପ୍ରାଇମର୍, ଅଲିଗୋ ଡିଟି କିମ୍ବା ଜିନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନ କରିପାରିବେ:
(1) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ |: ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ସୁପାରିଶ କରାଯାଏ;
()) ଲମ୍ବା ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡ: ଅଲିଗୋ dT / ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ସୁପାରିଶ କରାଯାଏ;
()) ଲମ୍ବା-ସେଗମେଣ୍ଟ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ର ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଖଣ୍ଡ |: ଜିନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ / ରାଣ୍ଡମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ / ରାଣ୍ଡମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ + ଅଲିଗୋ dT |ଯଦି ପରବର୍ତ୍ତୀ qPCR ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଏ, Oligo dT କୁ ଏକାକୀ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, କାରଣ କେବଳ ଅଲିଗୋ dT ବ୍ୟବହାର କରିବା ଦ୍ୱାରା ′ ′ ଶେଷ ପକ୍ଷପାତ ହୋଇପାରେ, ଯାହା ଭୁଲ qPCR ପରୀକ୍ଷଣ ଫଳାଫଳକୁ ନେଇଥାଏ |
(4) miRNA |: ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପ୍ରାଇମର୍ କିମ୍ବା ଟେଲିଙ୍ଗ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |

ପରିମାଣ ପାଇଁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଉତ୍ପାଦ cDNA କୁ କେତେ ଥର ମିଶ୍ରିତ କରାଯିବା ଉଚିତ୍?
ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଉତ୍ପାଦର cDNA ପାଇବା ପରେ, qPCR ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ କେତେଥର cDNA ମିଶ୍ରିତ ହେବା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ |ଯଦି cDNA ଏକାଗ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ କିମ୍ବା ଅତ୍ୟଧିକ କମ୍, ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତା ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇପାରେ |CDNA ଏକାଗ୍ରତା ମାପ କରାଯାଇପାରେ, ଏବଂ ଏହା କିପରି କରାଯିବା ଉଚିତ୍?
:ଏହି ସମୟରେ, କିଛି ବନ୍ଧୁ କହିବେ, ତା’ପରେ ମୁଁ ଶୁଦ୍ଧତା ପରେ ଏକାଗ୍ରତା ମାପ କରିବି;ଏଠାରେ, ଫୋରେଗେନ ମନେ ପକାଇବାକୁ ଚାହାଁନ୍ତି ଯେ cDNA କୁ ଶୁଦ୍ଧ ହେବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇନଥାଏ, କାରଣ ଓଲଟା ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ cDNA ର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ଭିନ୍ନ ଅଟେ, ଏବଂ କ୍ଷୁଦ୍ର cDNA ଶୁଦ୍ଧକରଣରେ ହଜିଯିବ |
(2) ତେବେ କଣ କରିବା?QPCR ପରୀକ୍ଷଣ ପୂର୍ବରୁ, cDNA ର ମିଶ୍ରଣ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ପୂର୍ବ ପରୀକ୍ଷଣ ମାଧ୍ୟମରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇପାରେ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ: qPCR ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ cDNA ଷ୍ଟକ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍, 10 ଗୁଣା ଦିଲ୍ୟୁସନ୍ ଏବଂ 100 ଗୁଣା ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଏବଂ 18-28 ପରିସର ମଧ୍ୟରେ CT ମୂଲ୍ୟ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କାରକ ଚୟନ କରନ୍ତୁ |

MiRNA ଗୁଡ଼ିକୁ କିପରି ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କରାଯିବା ଉଚିତ୍?
miRNA ହେଉଛି ଏକ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଛୋଟ ଅଣୁ RNA ଯାହା ପ୍ରାୟ 22 nt ଆକାର ବିଶିଷ୍ଟ ଯାହା ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ କୋଡ୍ କରେ ନାହିଁ |ଏହାର ସ୍ୱଳ୍ପ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ହେତୁ, ପାରମ୍ପାରିକ qPCR ପଦ୍ଧତି ଏହାକୁ ସିଧାସଳଖ ପରିମାଣ କରିବା କଷ୍ଟକର, ତେଣୁ miRNA ବିସ୍ତାର କରିବା ପ୍ରାୟତ necessary ଆବଶ୍ୟକ ହୋଇଥାଏ |miRNA ପାଇଁ ସାଧାରଣତ used ବ୍ୟବହୃତ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକରେ ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତି ଏବଂ ଟେଲିଙ୍ଗ୍ ପଦ୍ଧତି ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |
ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତି ହେଉଛି ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଯୋଗ କରି miRNA କୁ ବିସ୍ତାର କରିବା |ଏହି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତିର ଉଚ୍ଚ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଅଛି, କିନ୍ତୁ ଚିହ୍ନଟ ଥ୍ରୋପପୁଟ୍ କମ୍ ଅଟେ |ଗୋଟିଏ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କେବଳ ଗୋଟିଏ miRNA ଏବଂ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ |ଲାଞ୍ଜ-ଯୋଗ ପଦ୍ଧତି ଦୁଇଟିକୁ ନେଇ ଗଠିତ ଏହା ଦୁଇଟି ଏନଜାଇମର ମିଳିତ କାର୍ଯ୍ୟ ଦ୍ୱାରା ସମାପ୍ତ ହୋଇଛି, ଯାହା ହେଉଛି ପଲିଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ |ଏହାର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ବ to ାଇବାକୁ miRNA ରେ PolyA ଲାଞ୍ଜ ଯୋଡିବା ପାଇଁ PolyA ପଲିମେରେଜ୍ ଦାୟୀ, ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରିଥାଏ |ଏହି ପଦ୍ଧତିର ଉଚ୍ଚ ଚିହ୍ନଟ ଥ୍ରୋପପୁଟ ଅଛି ଏବଂ ଗୋଟିଏ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ରେ ଏକାଧିକ miRNA ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ, କିନ୍ତୁ ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତିରେ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା କମ୍ ଅଟେ |