RT-qPCR ପରୀକ୍ଷଣରେ RNA ନିଷ୍କାସନ ଏବଂ ଗୁଣାତ୍ମକ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଏବଂ qPCR ତିନୋଟି ସୋପାନ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ପଦକ୍ଷେପରେ ଅନେକ ସତର୍କତା ଅଛି, ଆମେ ନିମ୍ନରେ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପନ କରିବୁ |

Ⅰ।RNA ଗୁଣାତ୍ମକ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ |

RT-qPCR ପରୀକ୍ଷଣରେ, RNA ଉତ୍ତୋଳନ ସମାପ୍ତ ହେବା ପରେ, RNA ର ଗୁଣବତ୍ତା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ଅନୁସରଣ ପରୀକ୍ଷଣ କେବଳ ଯୋଗ୍ୟ ହେବା ପରେ କରାଯାଇପାରିବ |ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରଫୋଟୋମିଟର, ଆଜିଲିଣ୍ଟ ଜେଲ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍, ଆଜିଲିଣ୍ଟ 2100 ବିଶ୍ଳେଷଣ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯାହା ମଧ୍ୟରେ ସାଧାରଣତ used ବ୍ୟବହୃତ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରଫୋଟୋମିଟର ଏବଂ ଅଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ପଦ୍ଧତି ଚିହ୍ନଟ |ଏହା ମନେ ରଖିବା ଉଚିତ ଯେ RNA ଏକାଗ୍ରତା, ଶୁଦ୍ଧତା ଏବଂ ଅଖଣ୍ଡତାର ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କରିବା ପାଇଁ ଏହି ଦୁଇଟି ପଦ୍ଧତିକୁ ଏକତ୍ର ବ୍ୟବହାର କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଯାହାଫଳରେ RNA ର ଗୁଣବତ୍ତା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଏ |

ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା କିଟ୍: 

ସେଲ୍ ସମୁଦାୟ RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କିଟ୍ |

11 ମିନିଟରେ ବିଭିନ୍ନ ସଂସ୍କୃତ କୋଷରୁ ଉଚ୍ଚ ଶୁଦ୍ଧ ଏବଂ ଉଚ୍ଚମାନର ସମୁଦାୟ RNA ମିଳିପାରିବ |

ପଶୁ ସମୁଦାୟ RNA ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କିଟ୍ |

ବିଭିନ୍ନ ପଶୁ ତନ୍ତୁରୁ ଶୀଘ୍ର ଏବଂ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ଉଚ୍ଚ-ଶୁଦ୍ଧତା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ-ଗୁଣାତ୍ମକ ସମୁଦାୟ RNA ବାହାର କରନ୍ତୁ |

ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରଫୋଟୋମିଟର:

ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରଫୋଟୋମିଟର ମୁଖ୍ୟତ R RNA ର ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, କିନ୍ତୁ ଏହା RNA ଏବଂ ଜେନୋମିକ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶର ଅଖଣ୍ଡତା ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ନାହିଁ |ସେଥିମଧ୍ୟରୁ, A260 / 280 ଏବଂ A260 / 230 ହେଉଛି RNA ଶୁଦ୍ଧତା ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାରାମିଟର, ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଅନୁଯାୟୀ RNA ଶୁଦ୍ଧତା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ:

1. 1.9 2.1, RNA ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆଂଶିକ ଅବକ୍ଷୟକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇପାରିବ |

2. 2.0

ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍:

ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଅନୁଧ୍ୟାନ RNA ଅଖଣ୍ଡତା, ଜିନୋମ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିପାରିବ, କିନ୍ତୁ RNA ର ଏକାଗ୍ରତାକୁ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ଆକଳନ କରିପାରିବ ନାହିଁ କିମ୍ବା ଜ organic ବ ପୁନ ag ର ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ନାହିଁ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ ଇଉକାରିଓଟିକ୍ RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ନିଅନ୍ତୁ:

1. ଆରଏନଏ ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଅଧୀନରେ ରହିଲା |ଯଦି ଜେଲ୍ ମାନଚିତ୍ରରେ କେବଳ 28sRNA, 18sRNA ଏବଂ 5.8sRNA ର ତିନୋଟି ଏକକ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଥାଏ, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ଅଛି |ଯଦି ଏକ ଡ୍ରାଗ୍ ଘଟଣା ଅଛି, ଏହା RNA ର ଆଂଶିକ ଅବକ୍ଷୟକୁ ସୂଚିତ କରେ |

2. ଯଦି ଗ୍ଲୁ ହୋଲ୍ ଏବଂ 28sRNA ବ୍ୟାଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ଗୋଟିଏ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଅଛି, ସେଠାରେ ଜେନୋମିକ୍ DNA ଅବଶିଷ୍ଟ ରହିପାରେ |

3. ଯଦି ଗ୍ଲୁ ଗର୍ତ୍ତରେ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯାଏ, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର ପଦାର୍ଥର ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ରହିପାରେ |

Ⅱ. ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ |

RNA ନିଷ୍କାସନ ସମାପ୍ତ ହେବା ପରେ, ଏହାକୁ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ cDNA ରେ ଓଲଟା କରିବା ଆବଶ୍ୟକ, ତେଣୁ ଓଲଟା ପଦକ୍ଷେପ ଜରୁରୀ |ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଏବଂ ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନରୁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଉପସ୍ଥାପିତ ହେବ:

ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଚୟନ:

ସାଧାରଣ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଗୁଡିକରେ AMV RTase ଏବଂ MMLV RTase ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |AMV RTase ର RNase H ର ଦୃ strong କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ, କ୍ଷୁଦ୍ର ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଲମ୍ବ, କମ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପରିମାଣ ଏବଂ ଭଲ ତାପଜ ସ୍ଥିରତା (42 ~ 55 has) ଅଛି |MMLV RTase ର RNase H କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦୁର୍ବଳ, ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଲମ୍ବ ଲମ୍ବା, ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପରିମାଣ ଅଧିକ, ଏବଂ ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ଖରାପ (37 ~ 42 ℃) |

କାରଣ RNase H ଏନଜାଇମର RNA ଟେମ୍ପଲେଟକୁ ଖରାପ କରିବାର କାର୍ଯ୍ୟ ଅଛି, ଦୁର୍ବଳ RNase H କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ MMLV କୁ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସମୟରେ ପସନ୍ଦ କରାଯିବା ଉଚିତ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଜେନେଟିକ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ପରେ, MMLV ର ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ଏକ ଗୁଣାତ୍ମକ ସ୍ତରରେ ପହଞ୍ଚିଛି |ଫୋରେଗେନ ନେବାଫୋରେସି ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ (ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ M-MLV) ଏକ ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଏହା ଏକ ନୂତନ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଯାହା ଜେନେଟିକ୍ ରେକମ୍ବିନେସନ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ବ୍ୟବହାର କରି ଇ କୋଲି ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆରେ ପ୍ରକାଶିତ |ଏହା ଏକ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଯାହା ଏକକ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ RNA, DNA, କିମ୍ବା RNA: DNA ହାଇବ୍ରିଡରୁ ଏକ ସଂପୃକ୍ତ DNA ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡକୁ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରେ |ଏଥିରେ କ RN ଣସି RNase H କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ, ଦୃ strong ସ୍ଥିରତା, ଦୃ strong RNA ସମ୍ବନ୍ଧ, ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ଚିହ୍ନଟ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ନାହିଁ |

 

ଫୋରେସି ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ (ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ M-MLV)

ପ୍ରାଥମିକ ଚୟନ:

ସାଧାରଣତ RT ଆରଟି ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ତିନୋଟି ଶ୍ରେଣୀରେ ବିଭକ୍ତ: ଅଲିଗୋ ଡିଟି, ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍, ଏବଂ ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ |ବିଭିନ୍ନ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଆବଶ୍ୟକତା ଅନୁଯାୟୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନ କରନ୍ତୁ |

1. ଯଦି ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଇଉକାରିଓଟିକ୍ ଉତ୍ପତ୍ତି ଅଟେ ଏବଂ ରୁଟିନ୍ PCR ବିସ୍ତାର ପାଇଁ ବିଳମ୍ବ cDNA ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଓଲିଗୋ (dT) ସୁପାରିଶ କରାଯାଏ;ଯଦି ପରବର୍ତ୍ତୀ ପରୀକ୍ଷଣ କେବଳ qPCR ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଓଲିଗୋ (dT) ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିବା ପାଇଁ ଅନିୟମିତ ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |

2. ଯଦି ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପ୍ରୋକାରିଓଟ୍ସରୁ ଆସିଥାଏ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ କିମ୍ବା ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନ କରାଯିବା ଉଚିତ |

Ⅲ।qPCR

ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣକରଣ ମୁଖ୍ୟତ quant ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତି, ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ନୀତି, ROX ଚୟନ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସିଷ୍ଟମ୍ ବିନ୍ୟାସ ଏବଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅବସ୍ଥା ସେଟିଂ ଇତ୍ୟାଦିରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ |

ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତି ଚୟନ:

ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକ ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତି ଏବଂ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତିରେ ବିଭକ୍ତ |ଜିନ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଉପରେ କେତେକ ଚିକିତ୍ସା ପଦ୍ଧତିର ପ୍ରଭାବ ଚିହ୍ନଟ କରିବା, ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ ଜିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିର ପାର୍ଥକ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ଟିସୁରେ ଜିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିର ପାର୍ଥକ୍ୟ ତୁଳନା କରିବା ପାଇଁ ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିମାଣ ଜୀବାଣୁରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ପରିମାଣ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ |ପରୀକ୍ଷଣ କରିବାବେଳେ, ଆମେ ନିଜ ନିଜ ପରୀକ୍ଷଣ ଅନୁଯାୟୀ ଉପଯୁକ୍ତ ପରିମାଣିକ ପଦ୍ଧତି ବାଛିବା ଆବଶ୍ୟକ |

ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ନୀତି:

QPCR ପାଇଁ ପ୍ରାଇମରର ଡିଜାଇନ୍ ସିଧାସଳଖ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ଏବଂ ଉତ୍ପାଦ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସହିତ ଜଡିତ |ତେଣୁ, ଭଲ ପ୍ରାଇମର୍ଗୁଡ଼ିକୁ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ହେଉଛି ସଫଳ qPCR ର ପ୍ରଥମ ପଦକ୍ଷେପ |ପ୍ରାଇମରର ଡିଜାଇନ୍ରେ, ପାରମ୍ପାରିକ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ର ନୀତି ପୂରଣ କରିବା ସମୟରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ନୀତିଗୁଡିକ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଉଚିତ୍:

1. ଲକ୍ଷ୍ୟ ଖଣ୍ଡର ଲମ୍ବ 100 ରୁ 300 ବିପି ମଧ୍ୟରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ |

2. ଜେନୋମିକ୍ DNA ର ପ୍ରଭାବକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ କ୍ରସ୍-ଏକ୍ସନ୍ ଡିଜାଇନ୍;

3. ପରିକଳ୍ପିତ ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକ ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତା ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷା କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ଯେତେବେଳେ ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତା ମାନକ (90-110%) ରେ ପହଞ୍ଚେ ସେତେବେଳେ ସେଗୁଡିକ ପରିମାଣିକ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |

4. ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା ସାଧାରଣତ 0.1 0.1uM ରୁ 1.0uM ମଧ୍ୟରେ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ହୋଇଥାଏ |

ଚୟନROX:

ପରିମାଣିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ, ROX ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ପଥ ପାର୍ଥକ୍ୟ, ବାଷ୍ପୀକରଣ ଏବଂ ଘନୀକରଣ ଦ୍ caused ାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଭଲ୍ୟୁମ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ସମାନ ଭାବରେ ସଜାଡିପାରେ, ଫଳାଫଳଗୁଡିକର ପୁନରାବୃତ୍ତିରେ ଉନ୍ନତି ଆଣିବ |ତଥାପି, ଏହା ମନେ ରଖିବା ଉଚିତ ଯେ ROX ର ଚୟନ ଉପକରଣ ସହିତ ଜଡିତ |ଯଦି qPCR ଯନ୍ତ୍ରରେ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ଛିଦ୍ର ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ସଂଶୋଧନ କରିବାର କାର୍ଯ୍ୟ ଅଛି, ତେବେ ଏହାକୁ ROX ଯୋଡିବା ଆବଶ୍ୟକ ନାହିଁ |ଅନ୍ୟଥା, ଏହା ROX ସଂଶୋଧନ ଯୋଡିବା ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ରେଜେଣ୍ଟ କିଣିବାରେ ଛୋଟ ଅଂଶୀଦାରମାନେ ସଠିକ୍ ROX ବାଛିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଯନ୍ତ୍ର ଅନୁଯାୟୀ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ, ପରବର୍ତ୍ତୀ ତ୍ରୁଟିରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |

ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀର ପ୍ରସ୍ତୁତି:

20ul ଏବଂ 50ul ର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣକୁ ଅଧିକ ପସନ୍ଦ କରାଯାଏ |ସିଷ୍ଟମ୍ ଗଠନ ହେବାବେଳେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ବିଷୟଗୁଡ଼ିକ ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଉଚିତ୍:

1. ଅଲ୍ଟ୍ରା-କ୍ଲିନ୍ ୱର୍କବେଞ୍ଚ, ନୂତନ ddH ରେ ଭେଣ୍ଟିଲେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ପ୍ରସ୍ତୁତ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ |₂ପ୍ରତ୍ୟେକ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ O ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ;

2. ପ୍ରତ୍ୟେକ ପରୀକ୍ଷଣରେ ସିଷ୍ଟମରେ ପ୍ରଦୂଷଣ ଅଛି କି ନାହିଁ ଯାଞ୍ଚ କରିବାକୁ NTC ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ସିଷ୍ଟମ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ସମୟରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଯୁଗଳ ପ୍ରାଥମିକତା NTC କରିବା ଆବଶ୍ୟକ କରନ୍ତି;

3. RNA ଟେମ୍ପଲେଟରେ gDNA ଅବଶିଷ୍ଟ ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ଜାଣିବା ପାଇଁ, NRT ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ପ୍ରସ୍ତୁତ ହୋଇପାରିବ;

4. ସିଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବାବେଳେ, ଗୋଟିଏ ନମୁନା ପାଇଁ ଅତି କମରେ 3 ଯାନ୍ତ୍ରିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି;

5. ଯେତେବେଳେ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ cDNA ଅଟେ, qPCR ପରୀକ୍ଷଣରେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସିଷ୍ଟମର ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ପ୍ରଭାବକୁ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ 5-10 ଥର ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ଦ୍ୱାରା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ପରିମାଣକୁ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବା ଭଲ, ଯାହାଦ୍ୱାରା CT ମୂଲ୍ୟ 20-30 ମଧ୍ୟରେ ପଡ଼େ;

6. ଆବଶ୍ୟକ ସଂଖ୍ୟକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରନ୍ତୁ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସଂଖ୍ୟା ଆଧାରରେ 5-10% ବୃଦ୍ଧି କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ଭଲ୍ୟୁମ୍ ବିନ୍ୟାସ ସଂଖ୍ୟା ଗଣନା କରନ୍ତୁ;

7, ସେଣ୍ଟ୍ରାଇଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ପରେ ମିଶ୍ରଣ ଏବଂ କ bub ଣସି ବୁବୁଲ୍ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ ପ୍ରିମିକ୍ସ ନୀତି ବ୍ୟବହାର କରି ସିଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ |

8, ଉପଯୋଗୀ ସାମଗ୍ରୀ ବାଛିବା ପାଇଁ ଯଥାସମ୍ଭବ |

ସମ୍ବନ୍ଧିତ RT-qPCR କିଟ୍ |