ଚିହ୍ନଟର ବିଶେଷତା |
ଅଧିକାଂଶ କ୍ଷେତ୍ରରେ, PCR ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ବ imize ାଇବା ପାଇଁ ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ |ଅନେକ ଭେରିଏବଲ୍ ର ଅଧିକ କିମ୍ବା କମ ପୂର୍ବାନୁମାନଯୋଗ୍ୟ ପ୍ରଭାବ ଦ୍ୱାରା ଏହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |ଗୋଟିଏ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭେରିଏବଲ୍ ହେଉଛି ପ୍ରାଇମର 3′end ରେ କ୍ରମ |
ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଥିବା PCR ଅନୁଧ୍ୟାନଗୁଡିକ ଏକ ବ୍ୟାପକ ଗତିଶୀଳ ପରିସର ଉପରେ ଉଚ୍ଚ ଦକ୍ଷତା ବଜାୟ ରଖିବାର ସମ୍ଭାବନା ଅଧିକ, କାରଣ ଆସେ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦ ଉତ୍ପାଦନ କରେ ନାହିଁ, ଯାହା ଦ୍ PCR ାରା PCR ରେଜେଣ୍ଟସ୍ ସହିତ ପ୍ରତିଦ୍ୱନ୍ଦ୍ୱିତା ହୁଏ କିମ୍ବା ମୁଖ୍ୟ ବିସ୍ତାର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରେ |
ଅବଶ୍ୟ, କେତେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଯେତେବେଳେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ହେଉଛି ଘନିଷ୍ଠ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ପରିମାଣ କରିବା କିନ୍ତୁ ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ ପାଥୋଜେନ, ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ଡିଜାଇନ୍, ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଏବଂ ଯାଞ୍ଚ ମାନକ ଆବଶ୍ୟକ |
ତରଳିବା ବକ୍ର ହେଉଛି ଆମ୍ପଲିକନ୍ ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ମାନକ ପ୍ରଣାଳୀ, ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ ଗୋଟିଏ ଲକ୍ଷ୍ୟକୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯିବ କି ନାହିଁ |ତଥାପି, ଏହା ଉପରେ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଆଯିବା ଆବଶ୍ୟକ ଯେ ତରଳିବା ବକ୍ରଗୁଡିକ ବିଭ୍ରାନ୍ତିକର ହୋଇପାରେ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ସବୋପିଟିମାଲ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ନିମ୍ନ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏକାଗ୍ରତାର ମିଳିତ ପ୍ରଭାବ ଦ୍ୱାରା ସେମାନେ ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇପାରନ୍ତି |
P5 |ତରଳିବା ବକ୍ରଟି ବିଭିନ୍ନ ପରିମାଣର ଦୁଇଟି ଟାର୍ଗେଟର DNA ର ଦୁଇଟି ଚିହ୍ନଟରୁ ପ୍ରାପ୍ତ Tm ଶିଫ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ଦର୍ଶାଏ |
ଉ: ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତା (ବିଜ୍ଞାପନ) ରେ, qPCR ମାପ ସମାପ୍ତ ହେବା ପରେ କ obvious ଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ନାହିଁ |ଯେହେତୁ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏକାଗ୍ରତା 50 କପି (ଇ) କୁ ହ୍ରାସ ହୁଏ, ଏକ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉତ୍ପାଦ ଦେଖାଯିବା ଆରମ୍ଭ କରେ ଏବଂ ସର୍ବନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତା (f) ରେ ଏକମାତ୍ର ଉତ୍ପାଦ ହୋଇଯାଏ |
ବି ପରୀକ୍ଷା ସମସ୍ତ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏକାଗ୍ରତାରେ ସମାନ Tms ରେକର୍ଡ କଲା, ଏବଂ ସର୍ବନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତା (5 କପି) ରେ ମଧ୍ୟ କ obvious ଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ନଥିଲା |ଏହି ଦୁଇଟି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିବାବେଳେ, NTC ରେ କ pl ଣସି ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା |
P5 ନମୁନା ସହିତ ପ୍ରାପ୍ତ ବିଲୋପ ବକ୍ରଗୁଡ଼ିକୁ ଦର୍ଶାଏ ଯେଉଁଥିରେ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବିଭିନ୍ନ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଉପସ୍ଥିତ |P 5a ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଦୁଇଟି ସର୍ବନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତାରେ, ଉତ୍ପାଦିତ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର Tms ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆମ୍ପଲିକନ୍ ତୁଳନାରେ କମ୍ ଅଟେ |
ଆଜ୍ଞା ହଁ, ନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଥିବା ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏହି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |
କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, NTC ଗୁଡିକ, ଅର୍ଥାତ୍, କ D ଣସି DNA ସହିତ ନମୁନାଗୁଡିକ, (ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ) ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ରେକର୍ଡ କରିନଥିଲେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଜେନୋମିକ୍ DNA ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧନ / ପଲିମେରାଇଜେସନ୍ରେ ଅଂଶଗ୍ରହଣ କରିପାରିବ |
ବେଳେବେଳେ ଏହିପରି ପୃଷ୍ଠଭୂମି ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧନକୁ ପ୍ରତିକାର କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ ଏକ ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତିକୁ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ସମ୍ଭବ, ଯାହାର କ any ଣସି ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ NTC (P 5b) ରେ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବର୍ଦ୍ଧନ ନାହିଁ |
ଏଠାରେ, Cq 35 ସହିତ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏକାଗ୍ରତାର ବିସ୍ତାରକୁ ରେକର୍ଡିଂ କରିବା ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିଲୋପ ବକ୍ର ଉତ୍ପାଦନ କରିବ |ସେହିପରି, NTC ଗୁଡିକ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାରର କ signs ଣସି ଚିହ୍ନ ଦେଖାଇଲେ ନାହିଁ |ବେଳେବେଳେ, ଚିହ୍ନଟ ଆଚରଣ ମାତା ମଦ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ ହୋଇପାରେ, ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବଫର୍ ରଚନାରେ କେବଳ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାର ଚିହ୍ନଟ ହୁଏ, ଯାହା ବିଭିନ୍ନ Mg2 + ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ |
ଚିହ୍ନଟ ସ୍ଥିରତା |
Ta ର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ହେଉଛି qPCR ଚିହ୍ନଟର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଯାଞ୍ଚ ଏବଂ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଏକ ଉପଯୋଗୀ ପଦକ୍ଷେପ |ଏହା ତାପମାତ୍ରା (କିମ୍ବା ତାପମାତ୍ରା ପରିସର) ଦେଖାଇ ପ୍ରାଇମର୍ ସେଟ୍ ର ଦୃ ust ତାର ଏକ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ସୂଚକ ପ୍ରଦାନ କରେ ଯାହା NTC କୁ ବୃଦ୍ଧି ନକରି ସର୍ବନିମ୍ନ Cq ଉତ୍ପାଦନ କରେ |
ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାର ଦୁଇରୁ ଚାରି ଗୁଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଉଚ୍ଚ mRNA ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଥିବା ଲୋକଙ୍କ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇନପାରେ, କିନ୍ତୁ ଡାଇଗ୍ନୋଷ୍ଟିକ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ଏହା ସକାରାତ୍ମକ ଏବଂ ମିଥ୍ୟା ନକାରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳ ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ବୁ .ାଇପାରେ |
QPCR ପ୍ରାଇମର୍ ର Ta ଗୁଣ ବହୁତ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |କେତେକ ପରୀକ୍ଷା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଦୃ ust ନୁହେଁ, ଏବଂ ଯଦି ସେଗୁଡିକ ପ୍ରାଥମିକର ସର୍ବୋଚ୍ଚ Ta ମୂଲ୍ୟ ଅଧୀନରେ କରାଯାଏ ନାହିଁ, ତେବେ ସେମାନେ ଶୀଘ୍ର ନଷ୍ଟ ହୋଇଯିବେ |
ଏହା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କାରଣ ବାସ୍ତବ ଦୁନିଆରେ ଏହି ପ୍ରକାରର ଚିହ୍ନଟ ପ୍ରାୟତ problem ସମସ୍ୟା ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ, ଏବଂ ନମୁନାର ଶୁଦ୍ଧତା, DNA ର ଏକାଗ୍ରତା କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ DNA ର ଉପସ୍ଥିତି ସର୍ବୋତ୍ତମ ହୋଇନପାରେ |
ଏହା ସହିତ, ଟାର୍ଗେଟ୍ କପି ସଂଖ୍ୟା ଏକ ବ୍ୟାପକ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ, ଏବଂ ପରୀକ୍ଷା ସେଟ୍ କରିବା ସମୟରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଥିବା ରେଜେଣ୍ଟସ୍, ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ ବାସନ, କିମ୍ବା ଯନ୍ତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |
P6 | ତାପମାତ୍ରା ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ PCR ଚିହ୍ନଟର ଭିନ୍ନ ଦୃ ust ତା ଦେଖାଏ |
ଉ: ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ RNA ରୁ ପ୍ରସ୍ତୁତ cDNA ରେ PCR କରିବା ପାଇଁ ବାୟୋଲାଇନ୍ ର ସେନ୍ସିଫ୍ୟାଷ୍ଟ SYBR ମାଷ୍ଟରମିକ୍ସ (କାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର BIO-98050) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
B. ବାୟୋ-ରାଡ୍ର CFX qPCR ଯନ୍ତ୍ର ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଆପାଲେନର ବିସ୍ତାର ମାନଚିତ୍ର ଏବଂ ବିଲୋପ ବକ୍ର (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG) |
C. ACSBG1 ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଗ୍ରାଫ୍ ଏବଂ ତରଳିବା ବକ୍ର (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) |
D. GFAP ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଗ୍ରାଫ୍ ଏବଂ ବିଲୋପ ବକ୍ର (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC) |
E. Cqs ବିଭିନ୍ନ ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ରେକର୍ଡ ହୋଇଛି, 7C ତାପମାତ୍ରା ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ଅଧୀନରେ ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା Cq ରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଦେଖାଏ |
P 6 ଏକ ଅବାଞ୍ଛିତ ପରୀକ୍ଷଣର ଏକ ସାଧାରଣ ଫଳାଫଳ ଦେଖାଏ, ଯେଉଁଠାରେ qPCR 59C ରୁ 67C (P 6a) ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ଟାସ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ତିନୋଟି ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଜିନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରି କାର୍ଯ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା |
ଏହା ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଗ୍ରାଫରୁ ଦେଖାଯାଇପାରେ ଯେ ଓପାଲିନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଆଦର୍ଶଠାରୁ ବହୁ ଦୂରରେ କାରଣ ସେମାନଙ୍କର ଉତ୍କୃଷ୍ଟ Ta ପରିସର ବହୁତ ସଂକୀର୍ଣ୍ଣ (ଚିତ୍ର 6 ବି), ଅର୍ଥାତ୍ Cqs ବହୁଳ ଭାବରେ ବିସ୍ତୃତ ହୋଇଛି, ଫଳସ୍ୱରୂପ Cqs ସେମାନଙ୍କର ସର୍ବୋଚ୍ଚ Cqs ଲୋ ସହିତ ଯଥେଷ୍ଟ ତୁଳନା କରାଯାଏ |
ଏହି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ଅସ୍ଥିର ଅଟେ ଏବଂ ସବୋପିଟିମାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ହୋଇପାରେ |ତେଣୁ, ଏହି ଯୁଗଳ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ପୁନ es ଡିଜାଇନ୍ ହେବା ଉଚିତ୍ |ଏହା ସହିତ, ତରଳିବା ବକ୍ର ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଇନସେଟ) ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଏହି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତିର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ମଧ୍ୟ ସମସ୍ୟା ହୋଇପାରେ, କାରଣ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଟା ର ତରଳିବା ବକ୍ର ଭିନ୍ନ ଅଟେ |
P 6c ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ACSBG1 ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ଉପରୋକ୍ତ ଓପାଲିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଦୃ ust ଅଟେ, କିନ୍ତୁ ଏହା ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆଦର୍ଶଠାରୁ ବହୁ ଦୂରରେ, ଏବଂ ଏହା ଉନ୍ନତ ହୋଇପାରେ |
ତଥାପି, ଆମେ ଜୋର ଦେଉଛୁ ଯେ ଦୃ ust ତା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ମଧ୍ୟରେ କ necessary ଣସି ଆବଶ୍ୟକୀୟ ସଂଯୋଗ ନାହିଁ, କାରଣ ଏହି ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ produced ାରା ଉତ୍ପାଦିତ ବିଲୋପ ବକ୍ର ସମସ୍ତ ଟାସ୍ (ଇନ୍ସେଟ) ରେ ସମାନ ଶିଖର ମୂଲ୍ୟ ଦେଖାଏ |
ଅନ୍ୟ ପଟେ, ଦୃ ust ତା ପରୀକ୍ଷା ଅଧିକ ସହନଶୀଳ ଅଟେ, P 6d ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା GFAP ପରୀକ୍ଷଣ ପରି ଟାସର ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରରେ ସମାନ Cqs ଉତ୍ପାଦନ କରିଥାଏ |
ସମାନ 8 ଡିଗ୍ରୀ ସେଲସିୟସ୍ ରେଞ୍ଜରେ ପ୍ରାପ୍ତ Cqs ର ପାର୍ଥକ୍ୟ 1 ରୁ କମ୍ ଅଟେ, ଏବଂ ବିଲୋପ ବକ୍ର (ଇନ୍ସେଟ) ଏହି ତାପମାତ୍ରା ପରିସରର ଚିହ୍ନଟ ବ characteristics ଶିଷ୍ଟ୍ୟକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ |ସୂଚନାଯୋଗ୍ୟ ଯେ ଗଣିତ ଟାସ୍ ଏବଂ ପ୍ରକୃତ Ta ପରିସର ବହୁତ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |
ଅନୁସନ୍ଧାନକାରୀମାନଙ୍କୁ ଦକ୍ଷ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିବାକୁ ଅନେକ ଗାଇଡଲାଇନ ଅଛି, ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ ଅଧିକାଂଶ ଦୀର୍ଘ-ସ୍ଥାପିତ ନିୟମ ଉପରେ ଆଧାରିତ ଏବଂ 3′end ପ୍ରାଇମର୍ ଉପରେ ବହୁ ଧ୍ୟାନ ଦିଆଯାଇଛି |ପ୍ରାୟତ '3' ଶେଷରେ ଏକ G କିମ୍ବା C ଏବଂ ଦୁଇଟି G କିମ୍ବା C ବେସ୍ (ଜିସି କ୍ଲମ୍ପ) ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଏ, କିନ୍ତୁ ଶେଷ 5 ବେସ୍ ମଧ୍ୟରୁ ଦୁଇଟିରୁ ଅଧିକ ନୁହେଁ |
ଅଭ୍ୟାସରେ, ଏହି ନିୟମ ଗବେଷକମାନଙ୍କୁ ମାର୍ଗଦର୍ଶନ କରିପାରିବ, କିନ୍ତୁ ସେଗୁଡିକ ସବୁ ପରିସ୍ଥିତିରେ ସଠିକ୍ ନୁହେଁ |
P7 |ପ୍ରାଇମର 3′end ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା କିମ୍ବା ଦକ୍ଷତା ଉପରେ କମ୍ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |
ଉ: ମାନବ HIF-1α (NM_181054.2) ଜିନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଥମିକ ସ୍ଥିତି |
B. six ଟି ପରୀକ୍ଷା ଜିନିଷକୁ ବ pl ାଇବା ପାଇଁ ଆଜିଲିଣ୍ଟ୍ ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ III SYBR ସବୁଜ ମାତା ମଦ (କ୍ୟାଟ୍ ନମ୍ବର 600882) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
C. ବାୟୋ-ରେଡ୍ର CFX qPCR ଯନ୍ତ୍ର ଏବଂ 3′end ପ୍ରାଇମର୍ ଦ୍ୱାରା ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଗ୍ରାଫ୍ ଏବଂ ତରଳିବା ବକ୍ର |NTC ଗୁଡିକ ଲାଲ ରଙ୍ଗରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପରୀକ୍ଷା ଆଇଟମ୍ ର D. Cqs ରେକର୍ଡ |
ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, P 7 ରେ ଫଳାଫଳ 3′end ନିୟମକୁ ବିରୋଧ କରେ |ସମସ୍ତ ଡିଜାଇନ୍ ମ ically ଳିକ ଭାବରେ ସମାନ ଫଳାଫଳ ଉତ୍ପାଦନ କରେ, କେବଳ ଦୁଇଟି ପ୍ରାଥମିକ ମିଶ୍ରଣ ସହିତ NTC ରେ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିସ୍ତାରକୁ ନେଇଥାଏ |
ତଥାପି, ଆମେ ଜିସି କ୍ଲିପ୍ ର ପ୍ରଭାବକୁ ସମର୍ଥନ କରିପାରିବୁ ନାହିଁ, କାରଣ ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, A କିମ୍ବା T କୁ ସର୍ବାଧିକ 30 ବେସ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରିବା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ହ୍ରାସ କରେ ନାହିଁ |
ପରୀକ୍ଷା C, ଯେଉଁଠାରେ F ପ୍ରାଇମର୍ GGCC ରେ ସମାପ୍ତ ହୁଏ, NTC ରେ Cqs ରେକର୍ଡ କରିଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ 30-ଶେଷରେ ଏହି କ୍ରମଗୁଡିକ ଏଡାଇବାକୁ ଚାହିଁପାରେ |ଆମେ ଜୋର ଦେଉଛୁ ଯେ ଏକ ପ୍ରାଥମିକ ଯୁଗଳର ସର୍ବୋତ୍ତମ 3′end କ୍ରମ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାର ଏକମାତ୍ର ଉପାୟ ହେଉଛି ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଭାବରେ କିଛି ପ୍ରାର୍ଥୀ ପ୍ରାଥମିକତାକୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା |
ବୃଦ୍ଧି ଦକ୍ଷତା |
ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଯଦିଓ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ PCR ଚିହ୍ନଟ କଦାପି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ, ଏନ୍ଜାଇମ୍, ମାତା ମଦ, ଯୋଗୀ ଏବଂ ସାଇକେଲ ଚାଳନା ସ୍ଥିତିକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରି ଏମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଦକ୍ଷତା ଅନେକ ଭିନ୍ନ ଉପାୟରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇପାରିବ |
PCR ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ଦକ୍ଷତାକୁ ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ, ଟାର୍ଗେଟ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ର 10 କିମ୍ବା 5 ଗୁଣ କ୍ରମିକ ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଭଲ, ଅର୍ଥାତ୍ “ମାନକ ବକ୍ର ପଦ୍ଧତି” |
ଯଦି ଏକ ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ବକ୍ର ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ PCR ଆମ୍ପଲିକନ୍ କିମ୍ବା ସିନ୍ଥେଟିକ୍ DNA ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ତେବେ ଏହି ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକର କ୍ରମିକ ମିଶ୍ରଣକୁ କ୍ରମାଗତ ପରିମାଣର ପୃଷ୍ଠଭୂମି DNA (ଯେପରିକି ଜେନୋମିକ୍ DNA) ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରାଯିବା ଉଚିତ |
P8 |PCR ର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତାକୁ ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ ଦିଲ୍ୟୁସନ୍ ବକ୍ର |
ଉ: PCR ଏବଂ ତରଳିବା ବକ୍ର ଅବସ୍ଥା ପାଇଁ HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ଏବଂ R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ଏବଂ Agilent's Brilliant III SYBR ଗ୍ରୀନ୍ ମାଷ୍ଟରମିକ୍ସ (କାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର 600882) ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
ବି।ତରଳିବା ବକ୍ର ଇନସେଟରେ ଦେଖାଯାଏ |
C. ଦ୍ୱିତୀୟ ସିଡିଏନ୍ଏ ନମୁନା ପାଇଁ ଆରଟିଓ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା, dilution, ଏବଂ କ୍ରମିକ ମିଶ୍ରଣ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଫଳାଫଳ ସମାନ ଥିଲା |
ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ସିଡିଏନ୍ଏ ନମୁନାରେ ସମାନ ଚିହ୍ନଟ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି P 8 ଦୁଇଟି ମାନକ ବକ୍ର ଦେଖାଏ, ଫଳାଫଳ ସମାନ ଦକ୍ଷତା, ପ୍ରାୟ 100%, ଏବଂ R2 ମୂଲ୍ୟ ମଧ୍ୟ ସମାନ, ଅର୍ଥାତ୍ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ତଥ୍ୟ ଏବଂ ରିଗ୍ରେସନ୍ ଲାଇନ୍ କିମ୍ବା ଡାଟା ଡିଗ୍ରୀ ମଧ୍ୟରେ ଫିଟ୍ ଡିଗ୍ରୀ |
ଦୁଇଟି ମାନକ ବକ୍ର ତୁଳନାତ୍ମକ, କିନ୍ତୁ ସମାନ ନୁହେଁ |ଯଦି ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଧାର୍ଯ୍ୟ କରିବା, ତେବେ ଏହା ନିଶ୍ଚିତ ହେବା ଉଚିତ ଯେ ଅନିଶ୍ଚିତତାକୁ ବ୍ୟାଖ୍ୟା ନକରି ଏକ କପି ସଂଖ୍ୟା ଗଣନା କରିବା ଗ୍ରହଣୀୟ ନୁହେଁ |
P9 | |ଏକ ମାନକ ବକ୍ର ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣ ସହିତ ଜଡିତ ମାପ ଅନିଶ୍ଚିତତା |.
ଉ: PCR ଏବଂ ତରଳିବା ବକ୍ର ଅବସ୍ଥା ପାଇଁ GAPDH (NM_002046) ପାଇଁ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |F: ACAGTTGCCATGTAGACC ଏବଂ R: TAACTGGTTGAGCACAGG ଏବଂ ବାୟୋଲାଇନ୍ ର ସେନ୍ସିଫାଷ୍ଟ SYBR ମାଷ୍ଟରମିକ୍ସ (କାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର BIO-98050) |
ବି ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଚାର୍ଟ, ତରଳିବା ବକ୍ର ଏବଂ ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ବକ୍ର ବାୟୋ-ରେଡର CFX qPCR ଯନ୍ତ୍ର ସହିତ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଛି |
C. ମାନକ ବକ୍ର ଗ୍ରାଫ୍ ଏବଂ 95% ଆତ୍ମବିଶ୍ୱାସ ବ୍ୟବଧାନ (CI) |
D. କପି ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ତିନୋଟି Cq ମୂଲ୍ୟର 95% ଆତ୍ମବିଶ୍ୱାସ ବ୍ୟବଧାନ, ମିଶ୍ରଣ ବକ୍ରରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ |
P 9 ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଏକ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ଗୋଟିଏ ମାନକ ବକ୍ରର ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳତା ପ୍ରାୟ 2 ଗୁଣ (95% ଆତ୍ମବିଶ୍ୱାସ ବ୍ୟବଧାନ, ସର୍ବନିମ୍ନରୁ ସର୍ବାଧିକ), ଯାହା ଆଶା କରାଯାଇପାରେ ସବୁଠାରୁ ଛୋଟ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳତା ହୋଇପାରେ |
ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଉତ୍ପାଦ:
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ସେପ୍ଟେମ୍ବର -20-2021 |
