ସାଧାରଣ PCR ଟେକ୍ନୋଲୋଜିରୁ RT-qPCR ବିକଶିତ ହୋଇଛି |ଏହା ପାରମ୍ପାରିକ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀରେ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରାସାୟନିକ ପଦାର୍ଥ (ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରଙ୍ଗ କିମ୍ବା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋବ) ଯୋଗ କରିଥାଏ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଭିନ୍ନ ଲ୍ୟୁମାଇସେଣ୍ଟ୍ ଯନ୍ତ୍ରକ real ଶଳ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ରକୃତ ସମୟରେ PCR ଆନ୍ଲିଙ୍ଗ୍ ଏବଂ ବିସ୍ତାର ପ୍ରକ୍ରିୟା ଚିହ୍ନଟ କରେ |PCR ର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚକ୍ରରେ ଉତ୍ପାଦ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପରିମାଣ ଗଣିବା ପାଇଁ ମାଧ୍ୟମରେ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |ସମ୍ପ୍ରତି, ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରଙ୍ଗ ପଦ୍ଧତି ଏବଂ ଅନୁସନ୍ଧାନ ପ୍ରଣାଳୀ |

ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରଙ୍ଗ ପଦ୍ଧତି:
କେତେକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ରଙ୍ଗ, ଯେପରିକି SYBR ଗ୍ରୀନ୍ Ⅰ, ପିକୋ ଗ୍ରୀନ୍, BEBO ଇତ୍ୟାଦି, ନିଜେ ଆଲୋକ ନିର୍ଗତ କରନ୍ତି ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ dsDNA ର ଛୋଟ ଖୋଲାରେ ବାନ୍ଧିବା ପରେ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ନିର୍ଗତ କରନ୍ତି |ତେଣୁ, PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଆରମ୍ଭରେ, ମେସିନ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବ ନାହିଁ |ଯେତେବେଳେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍-ଏକ୍ସଟେନ୍ସନ୍ (ଦୁଇ-ଷ୍ଟେପ୍ ପଦ୍ଧତି) କିମ୍ବା ଏକ୍ସଟେନ୍ସନ୍ ଷ୍ଟେଜ୍ (ତିନି-ଷ୍ଟେପ୍ ପଦ୍ଧତି) କୁ ଅଗ୍ରସର ହୁଏ, ଏହି ସମୟରେ ଡବଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ଖୋଲାଯାଏ, ଏବଂ ନୂତନ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ସମୟରେ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକ dsDNA ଛୋଟ ଗ୍ରୀଭରେ ମିଳିତ ହୋଇ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ନିର୍ଗତ ହୁଏ |PCR ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ବ As ିବା ସହିତ ଅଧିକରୁ ଅଧିକ ରଙ୍ଗ dsDNA ସହିତ ମିଳିତ ହୁଏ, ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ମଧ୍ୟ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥାଏ |SYBR ସବୁଜକୁ ଏକ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ ନିଅ |
ଅନୁସନ୍ଧାନ ପଦ୍ଧତି:
ଟାକମ୍ୟାନ୍ ପ୍ରୋବ ହେଉଛି ସାଧାରଣତ used ବ୍ୟବହୃତ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ପ୍ରୋବ |ଅନୁସନ୍ଧାନର 5 ′ ଶେଷରେ ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗୋଷ୍ଠୀ ଅଛି, ସାଧାରଣତ F FAM |ଅନୁସନ୍ଧାନ ନିଜେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଜିନ୍ ପାଇଁ ଏକ କ୍ରମ ସଂପନ୍ନ |ଫ୍ଲୋରୋଫୋରର ′ ′ ଶେଷରେ ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ କ୍ୱିଞ୍ଚିଂ ଗୋଷ୍ଠୀ ଅଛି |ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ରିଜୋନାନ୍ସ ଶକ୍ତି ସ୍ଥାନାନ୍ତରର ନୀତି ଅନୁଯାୟୀ (ଫରଷ୍ଟର ରିଜୋନାନ୍ସ ଶକ୍ତି ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ, FRET), ଯେତେବେଳେ ସାମ୍ବାଦିକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗ୍ରୁପ୍ (ଦାତା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଅଣୁ) ଏବଂ କ୍ୱିଞ୍ଚିଙ୍ଗ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗ୍ରୁପ୍ (ଗ୍ରହଣକାରୀ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଅଣୁ) ଯେତେବେଳେ ଉତ୍ତେଜନା ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ଓଭରଲେପ୍ ହୁଏ ଏବଂ ଦୂରତା ଅତି ନିକଟତର ହୁଏ (7-10nm), ଦାତା ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଉତ୍ତେଜନା ଗ୍ରହଣକାରୀ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ |ତେଣୁ, PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ଆରମ୍ଭରେ, ଯେତେବେଳେ ପ୍ରୋବଟି ସିଷ୍ଟମରେ ମୁକ୍ତ ଏବଂ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ, ସାମ୍ବାଦିକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗୋଷ୍ଠୀ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ନିର୍ଗତ କରିବେ ନାହିଁ |ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ କଲାବେଳେ, ପ୍ରାଇମର୍ ଏବଂ ପ୍ରୋବ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧେ |ସମ୍ପ୍ରସାରଣ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ପଲିମେରେଜ୍ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ନୂତନ ଶୃଙ୍ଖଳାକୁ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରେ |ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ର 5′-3 ′ ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି |ଅନୁସନ୍ଧାନରେ ପହଞ୍ଚିବାବେଳେ, ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ ଟେମ୍ପଲେଟରୁ ଅନୁସନ୍ଧାନକୁ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ କରିବ, ଖବରଦାତା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗୋଷ୍ଠୀକୁ କ୍ୱେଞ୍ଚର୍ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ଠାରୁ ପୃଥକ କରିବ ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗନାଲ୍ ମୁକ୍ତ କରିବ |ଯେହେତୁ ପ୍ରୋବ ଏବଂ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଗୋଟିଏ ପରେ ଗୋଟିଏ ସମ୍ପର୍କ ଅଛି, ପରୀକ୍ଷଣର ସଠିକତା ଏବଂ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଦୃଷ୍ଟିରୁ ଅନୁସନ୍ଧାନ ପଦ୍ଧତି ରଙ୍ଗ ପଦ୍ଧତିଠାରୁ ଉନ୍ନତ ଅଟେ |

QRT-PCR ର ଚିତ୍ର 1 ନୀତି |

ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ |
ନୀତିଗୁଡିକ:

ପ୍ରାଥମିକଗୁଡିକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ କ୍ରମର ସଂରକ୍ଷିତ ଅଞ୍ଚଳରେ ଡିଜାଇନ୍ ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ ଏହାର ବିଶେଷତା ରହିବା ଉଚିତ |

CDNA କ୍ରମ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସର୍ବୋତ୍ତମ, ଏବଂ mRNA କ୍ରମ ମଧ୍ୟ ଗ୍ରହଣୀୟ |ଯଦି ନୁହେଁ, DNA କ୍ରମର cds ଅଞ୍ଚଳ ଡିଜାଇନ୍ ଖୋଜ |
ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପରିମାଣିକ ଉତ୍ପାଦର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ହେଉଛି 80-150 ବିପି, ଲମ୍ବା ହେଉଛି 300 ବିପି, ପ୍ରାଇମର୍ ଲମ୍ବ ସାଧାରଣତ 17 17-25 ବେସ୍ ମଧ୍ୟରେ, ଏବଂ ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ବହୁତ ବଡ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |

G + C ବିଷୟବସ୍ତୁ 40% ରୁ 60% ମଧ୍ୟରେ, ଏବଂ 45-55% ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଟେ |
ଟିଏମ ମୂଲ୍ୟ 58-62 ଡିଗ୍ରୀ ମଧ୍ୟରେ |
ପ୍ରାଇମର୍ ଡାଇମର୍ ଏବଂ ସେଲ୍ଫ-ଡାଇମର୍ ଠାରୁ ଦୂରେଇ ରହିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ, (କ୍ରମାଗତ 4 ଯୁଗଳରୁ ଅଧିକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ବେସ୍ ଦେଖାଯାଏ ନାହିଁ) ହେୟାରପିନ ଗଠନ, ଯଦି ଏଡାଇ ହେବ ନାହିଁ, ΔG <4.5kJ / mol * କରନ୍ତୁ ଯଦି ଆପଣ ନିଶ୍ଚିତ କରିପାରିବେ ନାହିଁ ଯେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସମୟରେ gDNA ଅପସାରିତ ହୋଇଛି, ତେବେ ଇଣ୍ଟ୍ରୋନ୍ * 3 ′ ଏଣ୍ଡର ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ କରିବା ଭଲ ନୁହେଁ, ଏବଂ ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍ / ଏନ୍, ଏନ୍ ଏଣ୍ଡ, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏନ୍, ଏଡ,
ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ ହେଟେରୋଜେନିଜ୍ ବର୍ଦ୍ଧିତ କ୍ରମର ହୋମୋଲୋଜି 70% ରୁ କମ୍ କିମ୍ବା 8 ଟି ସଂପୃକ୍ତ ଆଧାର ହୋମୋଲୋଜି ଅଛି |
ଡାଟାବେସ୍:
କୀ ଶବ୍ଦ ଦ୍ୱାରା କଟନ୍ FGD ସନ୍ଧାନ |
ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍:
IDT-qPCR ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ |

Fig2 IDT ଅନ୍ଲାଇନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ଟୁଲ୍ ପୃଷ୍ଠା |

ଚିତ୍ର 3 ଫଳାଫଳ ପୃଷ୍ଠା ପ୍ରଦର୍ଶନ |
LncRNA ପ୍ରାଥମିକଗୁଡ଼ିକର ଡିଜାଇନ୍:
lncRNA:mRNA ପରି ସମାନ ପଦକ୍ଷେପ |
miRNA:ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତିର ନୀତି: ଯେହେତୁ ସମସ୍ତ miRNA ଗୁଡିକ ପ୍ରାୟ 23 nt ର କ୍ଷୁଦ୍ର କ୍ରମ, ତେଣୁ ସିଧାସଳଖ PCR ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, ତେଣୁ ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ କ୍ରମ ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ |ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ କ୍ରମ ହେଉଛି ପ୍ରାୟ 50 nt ର ଏକ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ DNA, ଯାହା ନିଜେ ଏକ ହେୟାରପିନ ଗଠନ କରିପାରିବ |3 'ଶେଷକୁ miRNA ଆଂଶିକ ଖଣ୍ଡ ସହିତ ଏକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଭାବରେ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇପାରିବ, ତା’ପରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ miRNA ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସମୟରେ ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ କ୍ରମ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ହୋଇପାରିବ ଏବଂ ସମୁଦାୟ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ 70bp ରେ ପହଞ୍ଚିପାରେ, ଯାହା qPCR ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥିର ହୋଇଥିବା ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦର ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ |MiRNA ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ଟେଲିଙ୍ଗ୍ |
ବୃଦ୍ଧି-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଚିହ୍ନଟ:
ଅନଲାଇନ୍ ବ୍ଲାଷ୍ଟ ଡାଟାବେସ୍: କ୍ରମ ସମାନତା ଦ୍ୱାରା କଟନ୍ FGD ବିସ୍ଫୋରଣ |
ସ୍ଥାନୀୟ ବିସ୍ଫୋରଣ: ସ୍ଥାନୀୟ ବ୍ଲାଷ୍ଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ଲାଷ୍ଟ + ବ୍ୟବହାରକୁ ଅନୁସରଣ କରନ୍ତୁ, ଲିନକ୍ସ ଏବଂ ମାକୋ ସିଧାସଳଖ ଏକ ସ୍ଥାନୀୟ ଡାଟାବେସ୍ ପ୍ରତିଷ୍ଠା କରିପାରିବେ, ଉବୁଣ୍ଟୁ ବାସ୍ ଇନଷ୍ଟଲ୍ କରିବା ପରେ win10 ସିଷ୍ଟମ୍ ମଧ୍ୟ କରାଯାଇପାରିବ |ସ୍ଥାନୀୟ ବ୍ଲାଷ୍ଟ ଡାଟାବେସ୍ ଏବଂ ସ୍ଥାନୀୟ ବିସ୍ଫୋରଣ ସୃଷ୍ଟି କରନ୍ତୁ;win10 ରେ ubuntu bash ଖୋଲନ୍ତୁ |
ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ: ଉପଲାଣ୍ଡ କପା ଏବଂ ସମୁଦ୍ର ଦ୍ୱୀପ କପା ହେଉଛି ଟେଟ୍ରାପ୍ଲଏଡ୍ ଫସଲ, ତେଣୁ ବିସ୍ଫୋରଣର ଫଳାଫଳ ପ୍ରାୟତ two ଦୁଇ କିମ୍ବା ଅଧିକ ମେଳ ହେବ |ଅତୀତରେ, ବ୍ଲାଷ୍ଟ କରିବା ପାଇଁ NAU cds କୁ ଡାଟାବେସ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରିବା ଦ୍ only ାରା କେବଳ କିଛି SNP ପାର୍ଥକ୍ୟ ସହିତ ଦୁଇଟି ହୋମୋଲୋଜି ଜିନ୍ ମିଳିବାର ସମ୍ଭାବନା ଅଛି |ସାଧାରଣତ ,, ଦୁଇଟି ହୋମୋଲୋଜି ଜିନ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଡିଜାଇନ୍ ଦ୍ୱାରା ଅଲଗା ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ, ତେଣୁ ସେମାନଙ୍କୁ ସମାନ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ |ଯଦି ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ଇନ୍ଦେଲ୍ ଅଛି, ପ୍ରାଇମର୍ ସାଧାରଣତ the ଇଣ୍ଡେଲରେ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇଛି, କିନ୍ତୁ ଏହା ପ୍ରାଇମର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନକୁ ନେଇପାରେ ମୁକ୍ତ ଶକ୍ତି ଅଧିକ ହୋଇଯାଏ, ଯାହା ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ହ୍ରାସ କରିଥାଏ, କିନ୍ତୁ ଏହା ଏଡିବାଯୋଗ୍ୟ ନୁହେଁ |

ପ୍ରାଥମିକ ଦଳୀୟ ଗଠନର ଚିହ୍ନଟ:
ପଦକ୍ଷେପ:ଅଲିଗୋ 7 → ଇନପୁଟ୍ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ କ୍ରମ ଖୋଲ → ସବ୍-ୱିଣ୍ଡୋ → ସେଭ୍ → ଟେମ୍ପଲେଟରେ ପ୍ରାଇମର୍ ଖୋଜ, ପ୍ରାଇମର୍ ଲମ୍ବ ସେଟ୍ କରିବାକୁ ctrl + D ଦବାନ୍ତୁ various ବିଭିନ୍ନ ଦଳୀୟ ସଂରଚନାକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କର, ଯେପରିକି ସେଲ୍ଫ-ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ ବଡି, ହେଟେରୋଡିମର୍, ହେୟାରପିନ, ମେଳ ଖାଉ ନାହିଁ | ଚିତ୍ର 4 ର ଶେଷ ଦୁଇଟି ଚିତ୍ର ହେଉଛି ପ୍ରାଇମରର ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳ |ସାମ୍ନା ପ୍ରାଇମରର ଫଳାଫଳ ଭଲ, ସେଠାରେ କ obvious ଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ଡାଇମର୍ ଏବଂ ହେୟାରପିନ ଗଠନ ନାହିଁ, କ୍ରମାଗତ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ବେସ୍ ନାହିଁ, ଏବଂ ମାଗଣା ଶକ୍ତିର ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ମୂଲ୍ୟ 4.5 ରୁ କମ୍, ଯେତେବେଳେ ପଛ ପ୍ରାଇମର୍ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ଦେଖାଏ 6 ଟି ବେସ୍ ସଂପନ୍ନ, ଏବଂ ମୁକ୍ତ ଶକ୍ତି ହେଉଛି 8.8;ଏହା ସହିତ, 3 ′ ଶେଷରେ ଏକ ଗମ୍ଭୀର ଡିମର୍ ଦେଖାଯାଏ ଏବଂ କ୍ରମାଗତ 4 ବେସର ଏକ ଡାଇମର୍ ଦେଖାଯାଏ |ଯଦିଓ ମାଗଣା ଶକ୍ତି ଅଧିକ ନୁହେଁ, 3 ′ ଡାଇମର୍ Chl ବର୍ଦ୍ଧନ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ ବର୍ଦ୍ଧନ ଦକ୍ଷତା ଉପରେ ଗୁରୁତର ଭାବରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇପାରେ |ଏଥିସହ, ହେୟାରପିନ, ହେଟେରୋମିଡର୍ ଏବଂ ମେଳ ଖାଉ ନ ଥିବା ଯାଞ୍ଚ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ |

Fig3 oligo7 ଚିହ୍ନଟ ଫଳାଫଳ |
ବୃଦ୍ଧି ଦକ୍ଷତା ଚିହ୍ନଟ:
PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା PCR ଫଳାଫଳକୁ ଗମ୍ଭୀର ଭାବରେ ପ୍ରଭାବିତ କରେ |QRT-PCR ରେ, ପରିମାଣିକ ଫଳାଫଳ ପାଇଁ ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା ବିଶେଷ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫରରେ ଥିବା ଅନ୍ୟ ପଦାର୍ଥ, ମେସିନ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅପସାରଣ କରନ୍ତୁ |QRT-PCR ର ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା ଉପରେ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକର ଗୁଣ ମଧ୍ୟ ବହୁତ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ଫଳାଫଳଗୁଡିକର ସଠିକତା ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଉଭୟ ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣ ଏବଂ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣ ପ୍ରାଥମିକତାର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ଚିହ୍ନଟ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଏହା ସ୍ recognized ୀକୃତ ହୋଇଛି ଯେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ qRT-PCR ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା 85% ରୁ 115% ମଧ୍ୟରେ ଅଛି |ଦୁଇଟି ପଦ୍ଧତି ଅଛି:
1. ମାନକ ବକ୍ର ପଦ୍ଧତି:
a।CDNA ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |
ଖ।ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ମିଶ୍ରଣ
c.qPCR
d।ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ ରେଖା ରିଗ୍ରେସନ୍ ସମୀକରଣ |
2. LinRegPCR |
LinRegPCR ହେଉଛି ପ୍ରକୃତ ସମୟ RT-PCR ତଥ୍ୟର ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ, ଯାହାକୁ SYBR ଗ୍ରୀନ୍ କିମ୍ବା ସମାନ ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନ ଉପରେ ଆଧାରିତ ପରିମାଣିକ PCR (qPCR) ତଥ୍ୟ ମଧ୍ୟ କୁହାଯାଏ |ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ଅଣ-ବେସଲାଇନ୍ ସଂଶୋଧିତ ତଥ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାରେ ଏକ ବେସ୍ ଲାଇନ୍ ସଂଶୋଧନ ପୃଥକ ଭାବରେ କରେ, ୱିଣ୍ଡୋ-ଅଫ୍-ଲାଇନାରିଟି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ ଏବଂ ତାପରେ PCR ଡାଟା ସେଟ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଏକ ସିଧା ଲାଇନକୁ ଫିଟ୍ କରିବା ପାଇଁ ର line ଖିକ ରିଗ୍ରେସନ୍ ଆନାଲିସିସ୍ ବ୍ୟବହାର କରେ |ଏହି ଲାଇନର ope ାଲରୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ନମୁନାର PCR ଦକ୍ଷତା ଗଣନା କରାଯାଏ |ଆମ୍ପିଲିକନ୍ ପ୍ରତି ହାରାହାରି PCR ଦକ୍ଷତା ଏବଂ ନମୁନାରେ Ct ମୂଲ୍ୟ ପ୍ରତି ନମୁନାରେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏକାଗ୍ରତା ଗଣିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଯାହା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ୟୁନିଟ୍ ଗୁଡିକରେ ପ୍ରକାଶିତ |ଡାଟା ଇନପୁଟ୍ ଏବଂ ଆଉଟପୁଟ୍ ଏକ Excel ସ୍ପ୍ରେଡସିଟ୍ ମାଧ୍ୟମରେ |କେବଳ ନମୁନା |
ମିଶ୍ରଣ ଆବଶ୍ୟକ, କ gra ଣସି ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ନାହିଁ |
ପଦକ୍ଷେପଗୁଡିକ ଆବଶ୍ୟକ:(ବୋଲ୍ CFX96 କୁ ଏକ ଉଦାହରଣ ଭାବରେ ନିଅ, ସ୍ୱଚ୍ଛ ABI ସହିତ ମେସିନ୍ ନୁହେଁ)
ପରୀକ୍ଷଣ:ଏହା ଏକ ମାନକ qPCR ପରୀକ୍ଷଣ |
qPCR ଡାଟା ଆଉଟପୁଟ୍:LinRegPCR ଦୁଇଟି ପ୍ରକାରର ଆଉଟପୁଟ୍ ଫାଇଲଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନିପାରେ: RDML କିମ୍ବା ପରିମାଣୀକରଣ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଫଳାଫଳ |ବାସ୍ତବରେ, ଏହା ମେସିନ୍ ଦ୍ cycle ାରା ଚକ୍ର ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସଙ୍କେତର ପ୍ରକୃତ-ସମୟ ଚିହ୍ନଟ ମୂଲ୍ୟ ଅଟେ, ଏବଂ ର ar ଖ୍ୟ ସେଗମେଣ୍ଟ ଦକ୍ଷତାର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମୂଲ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ବିସ୍ତାର ପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ |
ତଥ୍ୟ ଚୟନ: ସିଦ୍ଧାନ୍ତରେ, RDML ମୂଲ୍ୟ ବ୍ୟବହାର ଯୋଗ୍ୟ ହେବା ଉଚିତ୍ |ଏହା ଅନୁମାନ କରାଯାଏ ଯେ ମୋ କମ୍ପ୍ୟୁଟରର ସମସ୍ୟା ହେଉଛି ସଫ୍ଟୱେର୍ RDML ଚିହ୍ନି ପାରିବ ନାହିଁ, ତେଣୁ ମୋର ମୂଳ ତଥ୍ୟ ଭାବରେ ଏକ୍ସେଲ୍ ଆଉଟପୁଟ୍ ମୂଲ୍ୟ ଅଛି |ପ୍ରଥମେ ତଥ୍ୟର ଏକ ରୁଗ୍ଣ ସ୍କ୍ରିନିଂ କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି, ଯେପରିକି ନମୁନା ଯୋଡିବାରେ ବିଫଳତା ଇତ୍ୟାଦି | ପଏଣ୍ଟଗୁଡିକ ଆଉଟପୁଟ୍ ତଥ୍ୟରେ ବିଲୋପ ହୋଇପାରିବ (ଅବଶ୍ୟ, ଆପଣ ସେଗୁଡିକୁ ବିଲୋପ କରିପାରିବେ ନାହିଁ, LinRegPCR ପରବର୍ତ୍ତୀ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଏହି ପଏଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ଉପେକ୍ଷା କରିବ)

Fig5 qPCR ତଥ୍ୟ ରପ୍ତାନି |

ପ୍ରାର୍ଥୀ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ଚିତ୍ର 6 ଚୟନ |

ଡାଟା ଇନପୁଟ୍:ଯୋଗ୍ୟତା ବର୍ଦ୍ଧନ ଫଳାଫଳ ଖୋଲନ୍ତୁ।

LinRegPCR ଡାଟା ଇନପୁଟ୍ ର Fig7 ପଦାଙ୍କ |

ଫଳାଫଳ:ଯଦି କ rep ଣସି ପୁନରାବୃତ୍ତି ନାହିଁ, କ group ଣସି ଗୋଷ୍ଠୀକରଣ ଆବଶ୍ୟକ ନାହିଁ |ଯଦି ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଛି, ନମୁନା ଗ୍ରୁପିଂରେ ଗ୍ରୁପିଂ ଏଡିଟ୍ ହୋଇପାରିବ ଏବଂ ଜିନ୍ ର ନାମ ପରିଚାୟକରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥାଏ, ଏବଂ ସେହି ସମାନ ଜିନ୍ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ଗ୍ରୁପ୍ ହୋଇଯିବ |ଶେଷରେ, ଫାଇଲ୍ ଉପରେ କ୍ଲିକ୍ କରନ୍ତୁ, ଏକ୍ସେଲ୍ ରପ୍ତାନି କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦେଖନ୍ତୁ |ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂଅର ବିସ୍ତାରଣ ଦକ୍ଷତା ଏବଂ R2 ଫଳାଫଳ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହେବ |ଦ୍ୱିତୀୟତ ,, ଯଦି ଆପଣ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ବିଭକ୍ତ ହୁଅନ୍ତି, ସଂଶୋଧିତ ହାରାହାରି ବିସ୍ତାର କ୍ଷମତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରାଯିବ |ନିଶ୍ଚିତ କରନ୍ତୁ ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରାଇମରର ବିସ୍ତାର ଦକ୍ଷତା 85% ରୁ 115% ମଧ୍ୟରେ ଅଛି |ଯଦି ଏହା ବହୁତ ବଡ କିମ୍ବା ବହୁତ ଛୋଟ, ଏହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ପ୍ରାଇମରର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦକ୍ଷତା ଖରାପ |

ଚିତ୍ର 8 ଫଳାଫଳ ଏବଂ ଡାଟା ଆଉଟପୁଟ୍ |

ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପ୍ରକ୍ରିୟା:
RNA ଗୁଣବତ୍ତା ଆବଶ୍ୟକତା:
ଶୁଦ୍ଧତା:1.72.0 ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଅବଶିଷ୍ଟ ଆଇସୋଥାଇଓସିୟାନେଟ୍ ଥାଇପାରେ |ପରିଷ୍କାର ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ A260 / A230 ପ୍ରାୟ 2 ହେବା ଉଚିତ୍ .ଯଦି 230 nm ରେ ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଅବଶୋଷଣ ଥାଏ, ଏହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଫେନେଟ୍ ଆୟନ ପରି ଜ organic ବ ଯ ounds ଗିକ ଅଛି |ଏହା ସହିତ, ଏହା 1.5% ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରିବ |ମାର୍କର୍ କୁ ସୂଚିତ କରନ୍ତୁ, କାରଣ ssRNA ର କ den ଣସି ଡେନାଟେରେସନ୍ ନାହିଁ ଏବଂ ମଲିକୁଲାର୍ ଓଜନ ଲୋଗାରିଦମର ଏକ ର ar ଖ୍ୟ ସମ୍ପର୍କ ନାହିଁ, ଏବଂ ମଲିକୁଲାର୍ ଓଜନ ସଠିକ୍ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ |ଏକାଗ୍ରତା: ତତ୍ତ୍ୱଗତ ଭାବରେ |ନୁହେଁ100ng / ul ରୁ କମ୍, ଯଦି ଏକାଗ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ କମ୍, ଶୁଦ୍ଧତା ସାଧାରଣତ low କମ୍ ନୁହେଁ ଲମ୍ବା ନୁହେଁ |

Fig9 RNA ଜେଲ୍ |

ଏହା ସହିତ, ଯଦି ନମୁନା ମୂଲ୍ୟବାନ ଏବଂ RNA ଏକାଗ୍ରତା ଅଧିକ, ତେବେ ଏହାକୁ ବାହାର କରିବା ପରେ ଏହାକୁ ଅଲଗା କରିବା ପାଇଁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି, ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ RNA କୁ 100-300ng / ul ର ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତାରେ ମିଶାନ୍ତୁ |ଇନ୍ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା |, ଯେତେବେଳେ mRNA ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ହୁଏ, ଅଲିଗୋ (dt) ପ୍ରାଇମର୍ ଯାହା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ polyA ଲାଞ୍ଜ ସହିତ ବାନ୍ଧି ହୋଇପାରେ, ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଥିବାବେଳେ lncRNA ଏବଂ circRNA ମୋଟ RNA ର ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ miRNA ପାଇଁ miRNA- ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବେକ-ଲୁପ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ |ଅନେକ କମ୍ପାନୀ ବର୍ତ୍ତମାନ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ଟେଲିଙ୍ଗ୍ କିଟ୍ ଲଞ୍ଚ କରିଛନ୍ତି।ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତି ପାଇଁ, ଟେଲିଙ୍ଗ୍ ପଦ୍ଧତି ଅଧିକ ସୁବିଧାଜନକ, ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୋପପୁଟ ଏବଂ ପୁନ ag- ସଞ୍ଚୟକାରୀ, କିନ୍ତୁ ସମାନ ପରିବାରର miRNA ଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବାର ପ୍ରଭାବ ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ପଦ୍ଧତି ପରି ଭଲ ହେବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କିଟ୍ ରେ ଜିନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ (ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍) ର ଏକାଗ୍ରତା ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକତା ଅଛି |MiRNA ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ସନ୍ଦର୍ଭ ହେଉଛି U6 |ଷ୍ଟେମ୍-ଲୁପ୍ ଓଲଟା ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ, U6 ର ଏକ ଟ୍ୟୁବ୍ ଅଲଗା ଭାବରେ ଓଲଟା ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ U6 ର ଆଗ ଏବଂ ପଛ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ସିଧାସଳଖ ଯୋଡାଯିବା ଉଚିତ |ଉଭୟ circRNA ଏବଂ lncRNA ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଭାବରେ HKG ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବେ |ଇନ୍cDNA ଚିହ୍ନଟ,
ଯଦି RNA ସହିତ କ problem ଣସି ଅସୁବିଧା ନାହିଁ, cDNA ମଧ୍ୟ ଭଲ ହେବା ଉଚିତ |ଯଦିଓ, ଯଦି ପରୀକ୍ଷଣର ସିଦ୍ଧତା ଅନୁସରଣ କରାଯାଏ, ତେବେ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଜିନ୍ (ରେଫରେନ୍ସ ଜିନ୍, RG) ବ୍ୟବହାର କରିବା ଭଲ, ଯାହାକି cD ରୁ gDNA କୁ ପୃଥକ କରିପାରିବ |ସାଧାରଣତ ,, RG ଏକ ଗୃହରକ୍ଷୀ ଜିନ୍ |, HKG) ଚିତ୍ର 10 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି;ସେହି ସମୟରେ, ମୁଁ ସୋୟାବିନ୍ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ତିଆରି କରୁଥିଲି, ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ରେଫରେନ୍ସ ଭାବରେ ଇଣ୍ଟ୍ରନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଆକ୍ଟିନ୍ 7 ବ୍ୟବହାର କରୁଥିଲି |GDNA ରେ ଏହି ପ୍ରାଇମରର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଖଣ୍ଡର ଆକାର 452bp ଥିଲା, ଏବଂ ଯଦି cDNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ତେବେ ଏହା 142bp ଥିଲା |ତା’ପରେ ପରୀକ୍ଷା ଫଳାଫଳରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ cDNA ର ଏକ ଅଂଶ ପ୍ରକୃତରେ gDNA ଦ୍ୱାରା ଦୂଷିତ ହୋଇଛି, ଏବଂ ଏହା ମଧ୍ୟ ପ୍ରମାଣ କରିଛି ଯେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଫଳାଫଳରେ କ problem ଣସି ଅସୁବିଧା ନାହିଁ, ଏବଂ ଏହା PCR ପାଇଁ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ |ସିଧାସଳଖ cDNA ସହିତ ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଚଳାଇବା ଅଦରକାରୀ, ଏବଂ ଏହା ଏକ ବିସ୍ତାର ବ୍ୟାଣ୍ଡ, ଯାହା ବିଶ୍ୱାସଯୋଗ୍ୟ ନୁହେଁ |

ଚିତ୍ର 10 cDNA ଚିହ୍ନଟ |

QPCR ସର୍ତ୍ତଗୁଡ଼ିକର ନିର୍ଣ୍ଣୟ |କିଟ୍ ର ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ସାଧାରଣତ no କ problem ଣସି ଅସୁବିଧା ନାହିଁ, ମୁଖ୍ୟତ t tm ମୂଲ୍ୟର ପଦକ୍ଷେପରେ |ଯଦି ପ୍ରାଇମର୍ ଡିଜାଇନ୍ ସମୟରେ କିଛି ପ୍ରାଇମର୍ ଭଲ ଭାବରେ ଡିଜାଇନ୍ ହୋଇନଥାଏ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଟିଏମ୍ ମୂଲ୍ୟ ଏବଂ ତତ୍ତ୍ 60 ିକ 60 ° C ମଧ୍ୟରେ ଏକ ବଡ଼ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଦେଖାଯାଏ, ନମୁନାଗୁଡିକ ମିଶ୍ରିତ ହେବା ପରେ cDNA ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଏ, ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ ଏକ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ PCR ଚଲାନ୍ତୁ, ଏବଂ ଟିଏମ୍ ମୂଲ୍ୟ ଭାବରେ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ବିନା ତାପମାତ୍ରାକୁ ଏଡ଼ାଇବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରନ୍ତୁ |

ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ |

ପାରମ୍ପାରିକ ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣିକ PCR ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ପଦ୍ଧତି ମୂଳତ 2 2 ଅନୁଯାୟୀ |-ΔΔCT।ଡାଟା ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ |

ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଉତ୍ପାଦ:

ପ୍ରକୃତ ସମୟ PCR ସହଜ |^TM ଟାକମ୍ୟାନ୍ |

ପ୍ରକୃତ ସମୟ PCR ସହଜ |^TM YSYBR ଗ୍ରୀନ୍ I |

RT ସହଜ I (ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପାଇଁ ମାଷ୍ଟର ପ୍ରେମିକ୍ସ)

RT ସହଜ II (qPCR ପାଇଁ ପ୍ରଥମ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପାଇଁ ମାଷ୍ଟର ପ୍ରେମିକ୍ସ)